Флуоресцентного: Флуоресцентный микроскоп. Лабораторные микроскопы

Флуоресцентный микроскоп. Лабораторные микроскопы

Флуоресцентный микроскоп – система строящаяся на базе прямого или инвертированного микроскопа проходящего света с добавлением флуоресцентного модуля отраженного света. Флуоресцентные микроскопы универсальны, в большинстве случаев могут быть использованы как микроскопы для работы в видимом проходящем свете. В статье рассмотрены основы формирования флуоресцентного изображения, конструкция флуоресцентных микроскопов, объективы для флуоресценции и специальные высокочувствительные камеры.

Флуоресцентная микроскопия. Основы формирования флуоресцентного изображения.

Флуоресценция – физическое явление, заключающееся в поглощении кванта света веществом, способным флуоресцировать (флуорофором), с последующим быстрым испусканем другого кванта, со свойствами, отличными от исходного. По сути явление флуоресенции представляет из себя переход электронов по энергетическим уровням вещества. Энергия, получаемая атомом вещества при облучении делится на две части. Меньшая расходуется на релаксацию, а большая уходит на излучение фотона определенной энергии. Спектр флуоресценции сдвинут относительно спектра поглощения в сторону длинных волн.

Это явление получило название «Стоксов сдвиг». Его причиной являются безызлучательные релаксационные процессы. В результате часть энергии поглощенного фотона теряется, а испускаемый фотон имеет меньшую энергию, и, соответственно, большую длину волны. Рассмотрим, каким образом испускание и поглощение света реализовано во флуоресцентном микроскопе.

Флуоресцентный микроскоп. Ход лучей при флуоресцентных исследованиях. Конструкция флуоресцентных фильтр-блоков.

Флуоресцентный микроскоп строится на базе прямого или инвертированного лабораторного микроскопа добавлением флуоресцентных модулей: осветителя отраженного света, туррели флуоресцентных фильтр-кубов, специального источника света, и, опционально, план полу апохроматическими объективами (флуотарами), с расширенной спектральной пропускной характеристикой.

Флуоресцентный микроскоп обладает следующим ходом лучей. На рисунке приведена схема прямого микроскопа, в инвертированном микроскопе схема полностью аналогична, только зеркально отражена сверху вниз.

Ход лучей прямого флуоресцентного микроскопа

Из спектра, испускаемого флуоресцентным источником света, вырезается полоса возбуждения необходимой ширины. (На примере это синее возбуждение, около 450 нм). Возбуждающий луч отражается от дихроичного зеркала и попадает на образец через объектив. Дихроичное зеркало отражает лучи до определенной длины волны (в данном случае до 460 нм), и пропускает лучи с большей длинной волны. В образце флуорофоры поглощают возбуждающий синий свет, и испускают более длинноволновое излучение. Флуоресцентное свечение беспрепятственно проходит через дихроичное зеркало, а барьерный фильтр вырезает нам необходимый для изучения спектр. Его необходимость заключается в том, что иногда флуоресцентное свечение находится в очень широком диапазоне длин волн, что мешает исследователю установить природу и свойства интересующего образца.

Флуоресцентный фильтр блок – устройство, объединяющее в себе дихроичное зеркало и два фильтра. Обычно в флуоресцентный микроскоп устанавливается несколько фильтров, способных возбуждать флуоресценцию в различном спектре. В зависимости от флуоресцентных меток или красителей, нанесенных на образец, картина в каждом канале будет отличной. Ядерный материал клетки будет наблюдаться в одном канале, митохондрии в другом, а цитоплазма в третьем. Ни один метод контрастирования не может дать такое радикальное деление образца с малым контрастом.

Флуоресцентный фильтр блок. (флуоресцентный куб), конструкция и спектральная характеристика.

На рисунке изображен флуоресцентный фильтр блок (часто встречается название флуоресцентный куб) U-MWB2, производства компании Olympus, и его спектральная характеристика. Возбуждение 460-490 нм, дихроик 500 нм и эмиссия (или барьерный фильтр) 520+ нм. Это означает, что фильтр широкополосный, и позволяет наблюдать одновременно различный окрас разных флуоресцентных меток.

Осветители для флуоресцентной микроскопии.

Флуоресцентный осветитель должен обладать самым главным свойством: высокая пиковая мощность в каждой интересующей нас зоне спектра, включая ультрафиолет. Распространенными флуоресцентными источниками являются ртутные дуговые лампы HBO, металлогалоидные лампы, ксеноновые источники, лазеры и светодиоды. Рассмотрим подробно преимущества и недостатки источников

Ртутные лампы HBO

Самым распространенным осветителем является ртутная лампа HBO. Она используется как в рутинных лабораторных микроскопах, так и в высококачественных исследовательских системах. Это очень удобный и относительно недорогой осветитель, обладающий высокой мощностью.

Спектральная интенсивность ртутной лампы HBO 100

К недостаткам можно отнести лишь необходимость центровки лампы при установке для отдачи полной мощности, а также относительно короткий срок службы – от 100 до 300 часов в зависимости от модели. После этого срока спектр лампы меняется, уровень мощности падает. Лампу всегда необходимо менять точно в срок.

Ртутные флуоресцентные лампы HBO представлены в нашем каталоге. При установке лампы требуется юстировка оптической системы лампового домика, а также настройка положения лампы. Мы выполняем все необходимые работы по замене лампы, настройке микроскопа и сервисному обслуживанию, но вы можете заменить лампу самостоятельно, предварительно изучив инструкцию.

Спектральная чувствительность металлогалоидной лампы в сравнении со ртутной лампой HBO. Интенсивность пиков металлогалоидной лампы немного ниже, но мощность в межпиковых областях и ширина пиков позволяют получать качественные флуоресцентные изображения.

В последнее время, металлогалоидные флуоресцентные осветители устанавливаются на микроскоп все чаще, срок службы в 2000 часов, отсутствие необходимости юстировки, хорошие спектральные характеристики – все это помогает исследователям решать задачи быстрее. Что касается стоимости, то, конечно, такой источник стоит гораздо дороже ртутных ламп HBO.

Светодиодные флуоресцентные источники

Светодиодные источники света – самое перспективное направление из новых технологий в микроскопии. Эти универсальные полупроводниковые осветители обладают всеми функциями ламп накаливания и газоразрядных ламп, имея при этом возможность работать от батареек, а также низковольтных и недорогих импульсных блоков питания.

Спектральная характеристика светодиодов, использующихся в световой микроскопии.

Обладают меньшей мощностью чем ртутные и металлогалоидные осветители. Широко применяются в рутинных микроскопах, к примеру микроскоп для исследования туберкулеза Zeiss Primo Star iLed.

Лазеры.

Являясь идеальным источником света для флуоресцентной микроскопии широко применяются в конфокальных системах. Мощность лазеров огромна, спектральная характеристика представляющая полоску пропускания в узком диапазоне (1-2нм), высокая производительность и срок службы.
Более подробно о источниках света для световой микроскопии в статье на нашем сайте.

 

Камеры для флуоресцентных микроскопов. Мультиканальная флуоресценция.

Камеры для флуоресцентной микроскопии должны быть высокочувствительными и обладать достаточным разрешением для работы на объективах от 20х до 100х (обычно от 1 до 5 мегапикселей). Про необходимое разрешение микроскопных камер вы можете прочитать в соответствующей статье на нашем сайте.

Чувствительность камеры, высокое соотношение сигнал/шум, хорошее охлаждение – первое на что стоит обращать внимание при выборе камеры для установки на флуоресцентный микроскоп.

Флуоресцентные камеры черно-белые. Красочные флуоресцентные картинки получаются окрашиванием изображения в отдельных каналах в так называемые псевдоцвета. Это происходит в графическом редакторе, или в специальном программном обеспечении, решающем вопросы мультиканальной флуоресценции – объединения флуоресцентных изображений нескольких каналов в одно итоговое. Рассмотрим мультиканальную флуоресценцию на примере изображения кортикальных нейронов. Итоговое изображение сформировано из двух каналов. Изначальные фотографии черно-белые, мы присвоили им псевдоцвета, раскрасив их в синий и зеленый цвет. Обычно цвета выбираются исходя из близости к реальному флуоресцентному свечению получаемому на образце, но это не обязательно. Главное, мы можем детально изучить ядерный материал (синий канал) и дендриты (зеленый). Такой контрастной картины не удалось бы получить без флуоресцентной микроскопии.

Принцип работы флуоресцентного микроскопа — biocommerce.ru

Флуоресцентный микроскоп стал важнейшим инструментом в современной биологии и медицине. Он позволяет детально исследовать динамические процессы на уровне молекулярных и клеточных структур, предоставляя специалистам высокоточные изображения изучаемых объектов.

Флуоресцентный микроскоп для проведения исследований.

Основные понятия

Флуоресценция относится к процессам люминесценции, при которых чувствительные молекулы испускают свет, находясь в электронно-возбужденных состояниях, создаваемых физическими или химическими механизмами.

В данном случае свечение становится следствием воздействия излучений ультрафиолетового или видимого спектра.

Флуоресцирующие молекулы называют флуорофорами. Поглощение и испускание фотонов веществом происходят почти одновременно. При более длительном временном интервале между этими процессами целесообразно говорить о явлении фосфоресценции.

Сфера использования

Высокочувствительные флуоресцентные микроскопы широко используются в медико-биологических областях. Они позволяют наблюдать за локализацией молекул и микроорганизмов, визуализировать и исследовать их специфические особенности.

При этом флуоресценция не оказывает мощного угнетающего действия на клетки, что облегчает мониторинг их внутренних динамических процессов.

Подобные микроскопы также применяются в материаловедении. Они помогают при анализе составов химических субстанций, обнаружении нежелательных вещественных вкраплений, выявлении дефектов поверхностей и решении прочих подобных задач.

Кратко о методе флуоресцентной микроскопии

Метод основан на способности фоточувствительных молекул к структурной интеграции с микрообъектами. Они прикрепляются к образцам с помощью функциональных химических групп и при световом облучении возвращают часть поглощенных фотонов.

Исследователи принимают и анализируют интенсивность волновых сигналов, делая выводы о строении изучаемых объектов и протекающих в них процессах.

Принцип флуоресценции соединений.

Какие процессы участвуют

При флуоресценции происходят поглощение квантов и их последующее частичное высвобождение. Электроны облучаемого флуорофора приобретают дополнительную энергию и на мгновение перемещаются на более высокий энергетический уровень.

При возвращении в первичное состояние происходит высвобождение фотонов во внешнюю среду. В этом процессе часть энергии тратится на восстановление термодинамического равновесия, поэтому величина испускаемой волны больше длины волны возбуждения. Разницу между энергиями возбуждающего и испускаемого излучений называют стоксовым сдвигом.

Формирование изображения

Микроскопы оснащены электронными модулями, позволяющими визуализировать исследуемые объекты при низких уровнях световых сигналов. Эти узлы содержат устройства с зарядовой связью, способные преобразовывать волновую энергию в фототок.

Далее электрические заряды сканируются регистрами сдвига и преобразуются в аналоговые, а затем в цифровые сигналы. На основе полученных данных формируется изображение высокого разрешения в 12- или 16-битном формате.

Ключом к качественной визуализации является правильный подбор оптических фильтров, гарантирующих надежное разделение испускаемого тусклого от возбуждающего яркого света.

Оптическая схема микроскопа.

Подробно о конструкции и принципе работы микроскопа

Устройство разработано на базе традиционного оптического микроскопа, но имеет иной принцип работы. Исследуемый образец помечают люминесцирующими веществами, а затем с помощью сложной системы фильтров собирают испускаемые фотоны и визуализируют микрообъекты.

Устройство микроскопа

В основном прибор обладает всеми модулями, характерными для оптических микроскопов. Однако он, в отличие от них, оснащен флуоресцентным модулем.

Задачами данного технологического узла являются направление возбуждающего излучения на образец и последующее отделение отраженного света от общего потока. Для этого используется сложная система фильтров, объединенных в единый блок.

Также особенностью флуоресцентного микроскопа является тип осветителя. Оптические устройства в качестве источника света используют лампы накаливания с непрерывным спектром и максимумом в красной зоне.

Такие приборы плохо подходят для возбуждения флуоресцирующих красителей, поглощающих излучение в коротковолновом диапазоне. Вместо них применяют галогенные или светодиодные лампы.

Устройство флуоресцентного микроскопа.

Конструкция фильтров-блоков

В основе конструкции микроскопа лежит блок, включающий набор следующих оптических элементов:

• фильтра возбуждения;
• дихроичного светоделителя;
• эмиссионного фильтра.

Фильтр возбуждения принимает излучение от источника света, пропуская длины волн заранее установленного диапазона. Дихроичное зеркало сначала отражает фотоны через оптический объектив на образец, а затем направляет флуоресценцию к системе обнаружения. Далее на пути испускаемого излучения стоит эмиссионный фильтр, который блокирует нежелательные волны.

При установке фильтров важно обеспечить правильный угол наклона и ориентацию относительно светового пути, чтобы эффективно управлять фотонным потоком.

Производители помечают в основном белой точкой отражающую сторону дихроичного зеркала, а на остальных деталях указывают направляющие стрелки.

Конструкция и спектральная характеристика фильтр-блоков.

Используемые осветители

В качестве источников света люминесцентные микроскопы чаще используют галогенные лампы. Они имеют небольшие размеры, хорошую цветопередачу и невысокую стоимость. Однако из-за низкой яркости и малого срока службы эти устройства постепенно вытесняются светодиодными LED-элементами.

Источники света на основе LED-технологии считаются самыми востребованными в современной микроскопии. Это универсальные полупроводниковые осветители, обладающие широким набором спектральных характеристик. Они позволяют использовать излучение в диапазоне от ультрафиолетовой до ближней инфракрасной зоны.

Ранее в люминесцентной микроскопии широко применялись ртутные лампы высокого давления. Их использование запрещено российским законодательством с 2020 г.

Это надежные и непрерывно работающие установки, обладающие наиболее высокими значениями яркости по сравнению галогенными и светодиодными приборами.

Однако они имеют ряд существенных недостатков: малый срок службы, изменение спектральной характеристики с возрастом и продолжительные интервалы между выключением и включением.

Спектральная интенсивность ртутной лампы НВО 100.

Флуоресцентные камеры

Камера считается одним из важнейших и самых дорогих компонентов микроскопа. Она должна обладать высокой чувствительностью и низким уровнем шума, чтобы захватить как можно больше фотонов.

Для флуоресцентной визуализации предпочтительно монохромное устройство, которое обеспечивает одинаковое обнаружение сигналов на всех пикселях и увеличивает общую чувствительность.

Камера оснащается 1 из 2 типов матриц: прибором с зарядовой связью (CCD) или устройством на металл-оксид-полупроводниковых транзисторах (sCMOS).

Они преобразуют волновые сигналы в электрические заряды, которые поступают на усилитель, а затем передаются в аналогово-цифровой преобразователь.

В CCD-камерах все сигналы сканируются одновременно, что позволяет снизить уровень шума и повысить чувствительность. В sCMOS-устройствах считывание происходит произвольно, вследствие чего возникают нежелательные вибрации, искажается геометрия объектов при визуализации.

Выбор камеры зависит от типа исследуемых образцов, требуемой частоты кадров, угла обзора, разрешения и чувствительности. Например, для промышленных изысканий необходимы высокое качество изображений и скорость работы, а для медико-биологических исследований важнее чувствительность устройства.

Высокочувствительные камеры с большим разрешением.

Обозначения для фильтров

Производители разрабатывают собственные системы кодов для обозначения фильтров, используемых во флуоресцентной микроскопии, что нередко приводит к путанице в терминологии. Кодировка в основном отражает вещественный состав изделия или его функциональные свойства.

При маркировке фильтров возбуждения часто используют аббревиатуры UG и BG, обозначающие ультрафиолетовое и синее стекла соответственно.

Современные фильтры высокого разрешения с интерференционной оптикой многими производителями кодируются сокращением IF. На узкополосных моделях встречаются символы KP или SP.

Дихроичные светоделители маркируются следующими акронимами: DM — дихроичное зеркало, CBS — хроматический светоделитель, TK — щелевой делитель, FT — делитель цвета, RKP — узкополосный отражатель. Все эти обозначения взаимозаменяемы.

Эмиссионные фильтры кодируются следующими символами: L или LP — широкополосный элемент, GG или Y — желтое стекло, OG или O — оранжевое стекло, RG или R — красное стекло, BA — запирающее стекло, K — щелевой фильтр.

Иногда наряду с акронимом присутствует числовое значение, указывающее на длину волны в нанометрах, на которой фильтр достигает половины величины максимальной пропускной способности.

Флуоресцентный светофильтр.

Скорость обесцвечивания образцов

При исследовании микропрепаратов важно учитывать скорость процесса фотообесцвечивания — необратимого распада фоточувствительных молекул вследствие окисления их кислородом под воздействием светового потока высокой интенсивности.

Фотообесцвечивание неминуемо, но его скорость зависит от реакционной способности и окружения флуорофоров.

Для замедления процесса исследователи используют:

• специальные реагенты, способные менять фотофизические свойства флуорофоров посредством варьирования функциональных групп;
• фотостабильные красители;
• фильтры нейтральной плотности, уменьшающие количество фотонов, падающих на образец.

Кроме того, необходимо снижать интенсивность светового излучения и сокращать продолжительность волнового воздействия.

Иногда образец содержит собственные молекулы или органеллы, способные к люминесценции. Нередко они испускают волны той же длины, что и искусственно внедренные флуорофоры.

При визуализации сложно различать ожидаемые и эндогенные сигналы. В этом случае фотообесцвечивание может оказаться полезным. Образец подвергают длительному воздействию ультрафиолета для разрушения его собственных фоточувствительных компонентов. Затем в структуру изучаемого объекта внедряют флуоресцентные белки, с помощью которых осуществляют визуализацию.

О флуоресцентном микроскопе — Микросистемы

Принцип работы

Флуоресцентный микроскоп — оптический прибор, показывающий в увеличенном виде клетки, поверхности и частицы с флуоресцирующими красителями. Схематично механизм флуоресценции выглядит так: При облучении флуоресцирующего вещества (ФВ) светом с определенной длиной волны (частотой) электроны ФВ поглощают квант света, приобретают дополнительную энергию и переходят на более высокую орбиту. Электроны не могут долго оставаться в возбужденном состоянии на более высокой орбите и возвращаются на ранее занимаемую. При этом излишек энергии выпускается также в виде кванта света, но с меньшей энергией (частотой) или, соответственно, большей длиной волны. Часть энергии тратится на так называемую релаксацию. Разность длин волн возбуждающего и испускаемого света является основополагающим принципом наблюдений в флуоресцентной микроскопии.

 

Детектирование флуоресценции широко применяется в разных областях науки и является одним из самых чувствительных методов неразрушающего контроля. С помощью флуоресценции можно определить содержание всего одной молекулы связанной с флуорофором. Если в образце несколько флуорофоров, то для их детектирования используют узкополосные (с разным диапазоном волн), либо широкополосные блок-фильтры. При всех своих возможностях, флуоресцентный метод имеет и ограничения, так, например, не всегда можно подобрать фильтры так, чтобы исследовать отдельные флуорофоры (флуорохромы) в образце, если диапазоны длин волн их возбуждения пересекаются.

Подбирая фильтры для своих исследований, обратите внимание на флуоресцентный краситель. Для удобства подбора фильтров предлагаем ознакомиться со следующими таблицами:

Таблица №1

Таблица №2

В качестве источника света флуоресцентных (люминесцентных) микроскопов используются лампы — ртутные, металлогалидные, галогенные, светодиодные, а также лазеры.

Ртутные лампы – наиболее распространённые осветители для флуоресцентной микроскопии на данный момент, но они могут быть запрещены к закупке через государственные торги РФ с 2018 года. Эти лампы не могут обеспечить равномерную интенсивность в УФ и видимом диапазоне волн, их свечение наиболее интенсивно при длинах волн в 313, 334, 365, 406, 435, 546 и 578нм. Из-за такой пиковой интенсивности они часто используются для УФ возбуждения. У них существуют и проблемы с безопасностью, поэтому не рекомендуется их использование дольше срока годности, иначе они могут взорваться и повредить коллекторную линзу.

У галогенных ламп схожие с ртутными лампами проблемы, но вдвое-вчетверо больший ресурс. Тем не менее, из-за низкой интенсивности и отсутствия УФ части спектра они не так широко распространены как ртутные лампы.

Светодиодные лампы стали применять сравнительно недавно для флуоресцентной микроскопии. Они не требуют юстировки, полностью безопасны, имеют более равномерное распределение интенсивности, чем газоразрядные (ртутные, галогенные). Еще один плюс таких ламп: установив линзы Fly-eye, всё поле зрения будет равномерно освещено.

Лазеры испускают интенсивный когерентный световой пучок, имеющий малую расходимость. Благодаря когерентности пучка света разрешающая способность системы выше. Поэтому их используют для конфокальной микроскопии сверхвысокого разрешения.

Заключительный этап конфигурирования флуоресцентного микроскопа – это выбор фотокамеры. Для флуоресценции важно подобрать камеру с высоким динамическим диапазоном (чувствительностью), большим временем экспозиции, малым количеством шумов и большим размером пикселя, потому что каждая линза в оптическом пути микроскопа поглощает часть света, и на матрицу камеры попадает мало света. Да и само флуоресцентное свечение неравномерно. Наш мозг выполняет роль выдержки в камере и собирает усредненную картину флуоресценции, а камере необходимо время, чтобы на матрицу попало достаточно количество света от образца.

Камеры с пзс (ccd) матрицами и активным охлаждением предпочтительнее для слабой флуоресценции, потому что их матрицы чувствительнее кмоп (cmos) и меньше подвержены цифровым шумам.

Да, быстродействие (количество кадров в секунду) CCD камеры будет немного ниже, чем у CMOS, но для флуоресценции это не имеет решающего значения.

Современное программное обеспечение камер состоит из различных модулей. Для флуоресценции наиболее полезными окажутся модули сшивки изображения, подсчёта численности объектов, FRAP и FRET анализ (совмещение и наложение) флуоресцентных снимков. Все эти модули есть в программном обеспечении CellSens и BZ analyser.

Поскольку в конфокальной микроскопии тоже используют флуоресценцию, то уточним, что всё вышесказанное относится именно к эпифлуоресценции. Приведем краткий исторический очерк:

Первый эпифлуоресцентный микроскоп, в котором была решена проблема разделения возбуждающего света и флуоресцентного сигнала был сконструирован в 1929 году.

Этот микроскоп отличался от предыдущих щелевых флуоресцентных микроскопов тем, что детекция флуоресцентного сигнала осуществлялась только со стороны образца, поэтому наблюдатель видел только эмиссию света от флуорофора. С течением времени расширилась область применения таких микроскопов,например, флуоресцентные микроскопы стали использовать в материаловедении, для выявления дефектов поверхности, содержания полимеров в битуме, анализа краски и других. Возросшее разрешение флуоресцентных микроскопов позволяет вести более точную детекцию сигнала и получать более информативные изображения.Снимки стали информативнее, благодаря наложению изображений, снятых с использованием разных фильтров.

Микроскопия зародилась в Германии, и самые известные производители микроскопов Европы имеют немецкие корни. Однако,с конца двадцатого века, японские производители стали активно и на равных конкурировать с классической немецкой школой микроскопостроения.

Среди микроскопов классической немецкой школы особенно выделяются: Hund H600 FL, оснащённый слайдером с пятью блоками фильтров и ртутной лампой, а также Hund Wilovert AFL – инвертированный микроскоп с 100Вт ртутной лампой.

Японские производители микроскопов: корпорация Olympus – выпустившая первый серийный микроскоп в Азии, входящая в рейтинг лучших производителей оптики и компания Keyence – выпускающая роботизированные микроскопы для высокотехнологичных и точных производств.

Модели Olympus для флуоресценции:

• Лабораторный флуоресцентный микроскоп CX43 со светодиодным (LED) флуоресцентным модулем (с одним блоком фильтров).
• Исследовательские флуоресцентные микроскопы BX43, BX53 и BX63 оснащаются флуоресцентным светодиодным/ртутным или ксеноновым осветителем с турелью для восьми(маленьких) и шести (больших).блоков-фильтров.
• Инвертированный лабораторный флуоресцентный микроскоп CKX53 – комплектуется флуоресцентным модулем на 2 блока фильтров.
• Инвертированные исследовательские микроскопы IX73 и IX83 – оснащаются флуоресцентным модулем на 6 блок-фильтров. IX83 – может быть переоборудован в конфокальную систему.
• Флуоресцентные микроскопы на основе стереомикроскопов SZX10 и SZX16.

По вопросам консультации и поставки — свяжитесь с нами любым удобным способом:

+7 (495) 234-23-32 

[email protected]

Форма обратной связи

Основные понятия и значения во флуоресцентной микроскопии

Введение во флуоресцентную микроскопию

Поглощение и последующее переизлучение света органическими и неорганическими образцами обычно является результатом распространённого физического явления, называемого либо флуоресценцией, либо фосфоресценцией. Испускание света посредством флуоресценции происходит почти одновременно с поглощением возбуждающего света, благодаря относительно малому времени задержки между поглощением и испусканием фотона, которое обычно не превышает микросекундного интервала. При более длительном интервале между поглощением и испусканием света это явление называется фосфоресценцией.

Рис. 1. Эпи-флуоресцентный микроскоп

Впервые флуоресценция была описана в 1852 году британским учёным Джорджем Стоксом, который и ввёл в употребление этот термин при проведении экспериментов с флюоритом (плавиковым шпатом), испускающим красный свет при облучении ультрафиолетом. Стокс заметил, что длина волны флуоресцентного испускания всегда больше длины волны света возбуждения. Первые исследования в 19-м веке показали, что многие образцы (включая минералы, кристаллы, смолы, лекарственное сырьё, масла, хлорофилл, витамины и неорганические соединения) флуоресцируют при облучении их ультрафиолетом. Тем не менее, применение флуорохромов в биологических исследованиях для окрашивания компонентов тканей, бактерий и других болезнетворных организмов началось лишь в 1930-х годах.

Некоторые из этих красителей были крайне специфичны и стимулировали развитие флуоресцентной микроскопии.

Благодаря некоторым показателям, трудно достижимым традиционной контрастной оптической микроскопией, флуоресцентная микроскопия стала важным инструментом как в биологических и биомедицинских исследованиях, так и в материаловедении. Применение наборов флуорохромов позволило выделять высоко специфичные клетки и субмикроскопические клеточные компоненты среди не флуоресцирующих веществ. С помощью флуоресцентного микроскопа, на самом деле, можно обнаруживать даже отдельные молекулы. С помощью флуоресцентного мультиокрашивания различные красители могут идентифицировать несколько молекул-мишеней одновременно. И хотя пространственное разрешение флуоресцентного микроскопа ограничено снизу дифракционным пределом, зависящим от специфических характеристик образца, обнаружение флуоресцирующих молекул ниже этого предела вполне возможно.

Многие образцы, будучи облучёнными, демонстрируют автофлуоресценцию (без применения флуорохромов), и это явление широко используется в ботанике, петрологии и полупроводниковой промышленности. И напротив, изучение тканей животных или болезнетворных организмов часто осложнено либо чрезвычайно слабой, либо, наоборот, сильной неспецифичной автофлуоресценцией. Гораздо более важное значение в этом случае имеет внесение в ткани флуорохромов (или флуророфоров), возбуждаемых на определённой длине волны и испускающих свет с необходимой интенсивностью. Флуорохромы являются красителями, которые, самостоятельно прикрепляясь к видимым или невидимым структурам, обладают при этом высокой избирательностью по отношению к мишеням и высоким квантовым выходом (отношением числа испущенных к числу поглощённых фотонов). Бурный рост применения флуоресцентной микроскопии тесно связан с появлением новых синтетических и естественных флуорофоров, имеющих определённые профили интенсивности возбуждения и испускания и «нацеленных» на заданные биологические мишени.

Основы процессов возбуждения и испускания

Принцип работы флуоресцентного микроскопа заключается в облучении образца на длинах волн в необходимом и точно определённом интервале с последующим выделением гораздо более слабой испускаемой флуоресценции из потока возбуждающего света. В хорошо настроенном микроскопе достигать глаза или приёмного устройства должен лишь испускаемый свет, таким образом, чтобы наблюдаемые флуоресцирующие структуры накладывались на высоко контрастный очень тёмный (или чёрный) фон. Темнота фона, в общем, определяет пределы обнаружения, поскольку возбуждающий свет обычно в сотни тысяч, или даже миллионы, раз ярче испускаемой флуоресценции.

На рисунке 1 схематически изображён в разрезе современный эпифлуоресцентный микроскоп, предназначенный для наблюдений как в проходящем, так и в отражённом свете. Вертикальный осветитель, расположенный в центре, на одном конце имеет источник света (обозначенный на схеме как эпископический модуль) и насадку с фильтрами — на другом. В основе конструкции лежит микроскоп, работающий в отражённом свете, длина волны которого больше длины волны возбуждения. Автором вертикального осветителя для флуоресцентной микроскопии в отражённом свете считается Джон С. Плоем (Johan S. Ploem). Многочастотный свет от дуговой лампы или другого источника, проходя через селективный светофильтр возбуждения, преобразуется во флуоресцентном вертикальном осветителе в свет с определённой длиной волны (или в заданном волновом интервале), обычно из ультрафиолетового, синего или зелёного участков спектра. Пропущенный фильтром возбуждения поток отражается от поверхности дихроматического (также называемого дихроичным) зеркала или светоделителя и, пройдя через объектив, освещает образец интенсивным светом. Если образец флуоресцирует, испускаемый свет, собираемый объективом, опять проходит через дихроичное зеркало, после чего фильтруется запирающим (или эмиссионным) фильтром, который блокирует свет на длинах волн возбуждения. Важно заметить, что флуоресценция является единственным в оптической микроскопии режимом, при котором образец после облучения излучает свой собственный свет. Испускаемый свет переизлучается сферически во всех направлениях, независимо от расположения источника облучающего света.

Метод эпифлуоресцентного освещения является преобладающим в современной микроскопии. Вертикальный осветитель отражённого света располагается между тубусами наблюдения и револьверной головкой объективов. Осветитель устроен таким образом, что возбуждающий свет на пути к образу и от образца проходит через один и тот же объектив микроскопа, который в данной конфигурации сначала выступает в качестве конденсора, а на обратном пути собирает испущенный свет флуоресценции. Осветители этого типа имеют несколько преимуществ. Объектив флуоресцентного микроскопа выступает, во-перых, в качестве хорошо настроенного конденсора, а во-вторых, в качестве собирающего свет устройства, с помощью которого формируется изображение. Будучи одним и тем же компонентом, объектив/конденсор всегда превосходно отюстирован. Большая часть возбуждающего света, достигающего образца, проходит сквозь него без взаимодействия и не возвращается на объектив, а освещаемая область ограничена той частью образца, которая наблюдается через окуляры (в большинстве случаев). Если микроскоп правильно сконфигурирован для освещения по Кёллеру, то, в отличие от некоторых методов, усиливающих контраст, при наблюдении на нём доступна полная числовая апертура объектива. Кроме того, он позволяет комбинировать режимы наблюдения в проходящем и отражённом свете, режим формирования цифрового изображения, или выбирать один из них.

Рис. 2. Флуоресцентные фильтры

Как показано на рисунке 1, на заднем конце вертикального осветителя отражённого света расположен блок дуговой лампы (обычно ртутной или ксеноновой). Распространяясь вдоль осветителя перпендикулярно оптической оси микроскопа, возбуждающий свет проходит сквозь собирающие линзы, регулируемую и центрируемую апертурную диафрагму, а затем через регулируемую центрируемую полевую диафрагму (см. рисунок 1). После этого свет попадает на фильтр возбуждения, где происходит отбор длин волн из требуемого интервала и блокирование остальных длин волн. После прохождения фильтра возбуждения, отобранные длины волн достигают дихроичного светоделительного зеркала, являющегося специальным интерференционным фильтром, эффективно отражающим коротковолновый и эффективно пропускающим длинноволновый свет. Дихроичный светоделитель наклонён под углом 45 градусов по отношению к падающему на него возбуждающему свету и отражает его под углом 90 градусов через объектив оптической системы прямо на образец. Флуоресценция, испускаемая освещённым образцом, собирается объективом, выполняющим теперь уже свою обычную функцию, а именно формирование изображения. Поскольку испускаемые длины волн больше длин волн возбуждения, они проходят через дихроичное зеркало вверх к наблюдательным тубусам или электронному детектору.

Большинство рассеянного возбуждающего света, достигая дихроичного зеркала, отражается им обратно к световому источнику, хотя небольшая его доля может пройти насквозь или поглощается внутренним покрытием зеркала. Но до того, как испущенная флуоресценция достигнет окуляра или детектора, она должна пройти запирающий или заграждающий фильтр Эти фильтры блокируют (заграждают) любой остаточный возбуждающий свет, но пропускают более длинные волны испускаемого света. В большинстве осветителей отражённого света фильтр возбуждения, дихроичное зеркало и запирающий фильтр объединены в оптический блок (часто называемый кубом), как показано на рисунке 2. Современные флуоресцентные микроскопы могут вмещать от четырёх до шести фильтр-кубов (обычно на насадке карусельного или на выдвижного типа; см. рисунок 1) и позволяют пользователю легко устанавливать сменные фильтры возбуждения, запирающие фильтры и дихроичные зеркала.

Конструкция вертикального осветителя должна позволять пользователю настраивать микроскоп для освещения по Кёллеру, при котором обеспечивается яркое и равномерное освещение по всему полю зрения. Откорректированные конденсорные линзы оптической системы обеспечивают сопряжённость изображения центрируемой апертурной диафрагмы с задней апертурой фокусирующего объектива. В современных осветителях, изображение предварительно-сфокусированной, центрируемой полевой диафрагмы является сопряженныи со сфокусированным образом и плоскостью фиксированной диафрагмы окуляра.

Ламповый блок осветителя обычно содержит заграждающий фильтр, блокирующий инфракрасный свет. Сам ламповый блок не должен пропускать наружу ультрафиолетового излучения. Желательно, к тому же, чтобы в него был встроен автоматический выключатель, на случай его открытия во время работы. Ламповый блок должен быть достаточно прочным, чтобы выдержать возможный взрыв дуговой лампы в процессе работы. В современных ламповых блоках гнездо лампы оборудовано регулировочными ручками для центрирования изображения дуговой лампы в задней апертуре объектива (при освещении по Келлеру эти плоскости сопряжены). На пути света, обычно ближе к ламповому блоку, но перед фильтром возбуждения, желательно поставить задвижку, чтобы полностью блокировать возбуждающий свет, если не ведётся наблюдение образца. К тому же, в оснащение осветителя должны входить нейтральные светофильтры (на насадке барабанного, карусельного или выдвижного типа) для того, чтобы иметь возможность понизить интенсивность возбуждающего освещения.

Стоксов сдвиг

При переходе электронов из возбуждённого в основное состояние теряется колебательная энергия. В результате этой потери энергии спектр испускания возбуждённого флуророфора обычно сдвигается в сторону более длинных волн в сравнении со спектром поглощения или возбуждения (необходимо помнить, что длина волны обратно пропорциональна её энергии). Это известное явление называется правилом Стокса или стоксовым сдвигом. При увеличении стоксова сдвига становится легче разделять возбуждающий и испускаемый свет с помощью комбинаций флуоресцентных светофильтров.

Пик интенсивности испускания флуророфора обычно ниже пика интенсивности его поглощения и приходится на волну с большей длиной. Кривая испускания (спектральная кривая) часто является зеркальным (или близко к этому) отображением кривой возбуждения, но сдвинутой в сторону более длинных волн, как показано на рисунке 3, где представлен полезный своими спектральными характеристиками краситель Alexa Fluor 555, который поглощает в жёлто-зелёной, а испускает в жёлто-оранжевой области. Для достижения максимальной интенсивности флуоресценции, флуророфор (часто называемый красителем) возбуждается на длинах волн, близких к пику кривой возбуждения или приходящихся на самый её пик, при этом испускаемый свет регистрируется в максимально широком диапазоне, включающем пик испускания. Отбор возбуждающих и испускаемых длин волн производится с помощью интерференционных фильтров (рисунок 2). В дополнение следует отметить, что спектральные характеристики оптической системы микроскопа также зависят от коэффициентов пропускания стекла (на которые влияют просветляющие покрытия), количества линз и зеркал и чувствительности детекторов.

Рис. 3. Кривые поглощения и испускания флуорофора

Эффективность разделения и регистрации длин волн возбуждения и испускания достигается во флуоресцентной микроскопии правильным выбором светофильтров, блокирующих или, наоборот, пропускающих свет определённых длин волн в ультрафиолетовой, видимой и ближней инфракрасной области спектра. Контроль возбуждающего света производится в вертикальных флуоресцентных осветителях благодаря тому, что в их конструкции предусмотрено использование легко сменяемых фильтров (нейтральных и интерференционных светофильтров возбуждения), вставляемых на пути света к образцу и на обратном пути между образцом и тубусами наблюдения или системой приёма сигнала. Ввиду низкой интенсивности флуоресцентного свечения (о чём говорилось выше), необходимо чтобы источник возбуждающего света имел достаточную яркость для максимально возможного усиления слабого испускаемого света, а также, чтобы флуорохромы обладали соответствующими поглощательными характеристиками и квантовым выходом. Это, возможно, является ключевыми критериями флуоресцентной микроскопии.

Эффективность поглощения отдельным флуророфором фотона возбуждающего света является функцией эффективного молекулярного сечения, а вероятность такого события называется коэффициентом поглощения. Бо?льшие значения коэффициента поглощения говорят о том, что поглощение фотона (или кванта) в данном интервале длин волн более вероятно. Квантовым выходом обозначается отношение числа испущенных к числу поглощенных квантов (обычно оно лежит в интервале от 0,1 до 1,0). То, что квантовый выход принимает значения меньшие 1, является следствием потери энергии безызлучательным способом, например через тепло или фотохимическую реакцию, когда не происходит её переизлучения, приводящего к флуоресценции. Коэффициент поглощения, квантовый выход, средняя сила света, а также время высвечивания являются важными факторами, влияющими на интенсивность флуоресценции и определяющими целесообразность применения этого метода.

Фединг, тушение и фотообесцвечивание

Целый ряд условий может влиять на вероятность флуоресцентного переизлучения, часто приводя к падению интенсивности флуоресценции. Общим термином для обозначения уменьшения интенсивности флуоресцентного испускания является фединг, охватывающий все явления, которые для более подробного описания могут быть разделены на явления тушения и фотообесцвечивания. Фотообесцвечиванием называется необратимый распад флуоресцентных молекул в возбуждённом состоянии, вызванный их взаимодействием с молекулярным кислородом до момента испускания. Это явление используется в методе восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP), очень эффективном при изучении диффузионных свойств и движения биологических макромолекул. В основе метода лежит фотообесцвечивание лазерным пучком чётко определённой области в образце с последующим наблюдением скорости и характера восстановления флуоресценции в фотообесцвеченной области. Связанный с этим метод затухания флуоресценции в обесцвеченных изображениях (FLIP) применяется для исследования уменьшения флуоресценции в областях, прилегающих к фотообесцвеченной области. Как и FRAP, этот метод является эффективным инструментом в исследовании подвижности молекул и динамики в живых клетках.

Рис. 4. Скорость фотообесцвечивания мультиокрашенных образцов

На рисунке 4 представлен типичный пример фотообесцвечивания (фединга), наблюдаемого в серии цифровых изображений мультиокрашенной культуры фибробластов кожи индийского мунтжака, снятых в различные моменты времени. Ядра были окрашены дериватом бис-бензимидазола (хёхст 33258, синее свечение), а митохондрии и актиновый цитоскелет — красителем MitoTracker Red CMXRos (красное свечение) и дериватом фаллоидина, присоединённым к Alexa Fluor 488 (зелёное свечение), соответственно. Снимки производились через каждые две минуты, а комбинация флуоресцентных светофильтров была настроена таким образом, чтобы возбуждение всех трёх флуорофоров происходило одновременно, при одновременной регистрации комбинированных испускаемых сигналов. На рисунке 4(а) видно, что интенсивность всех трёх флуророфоров относительно высока, но интенсивность хёхста (синий) начинает быстро падать уже через две минуты и почти совсем пропадает через 6–8 минут. Красители митохондрий и актина оказываются более устойчивыми к фотообесцвечиванию, но и их интенсивность значительно падает за время наблюдения (10 минут).

Релаксация из возбуждённого состояния путём тушения, приводящая к падению интенсивности флуоресценции, происходит различными безизлучательными способами и часто возникает из-за окислителей или из-за присутствия солей, тяжёлых металлов и галогенных соединений. В некоторых случаях тушение происходит как результат передачи энергии другой молекуле (именуемой акцептором), которая находится близко к возбуждённому флуророфору (донору). Это явление называется резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET). Именно этот механизм стал основой эффективного метода изучения молекулярных взаимодействий и ассоциаций на расстояниях, значительно меньших разрешающей способности оптических микроскопов.

Флуоресцентные источники света

Неблагоприятным следствием низкой интенсивности испускания в большинстве приложений флуоресцентной микроскопии является низкое число фотонов, достигающих окуляра, либо приёмного устройства. В большинстве случаев, эффективность собираемости фотонов в оптических микроскопах меньше 30 процентов, а концентрации многих флуророфоров на оптическом пути меняются от микромолярных до наномолярных концентраций. Чтобы интенсивность возбуждающего света была достаточной для регистрации флуоресценции, необходимы мощные компактные источники света, такие как небольшие дуговые лампы с высокой энергией излучения. Наиболее распространёнными являются ртутные лампы мощностью от 50 до 200 ватт и ксеноновые лампы мощностью от 75 до 150 ватт (см. рисунок 5). Эти лампы обычно питаются от внешнего источника постоянного тока, достаточного для того, чтобы зажечь дуговой разряд через ионизацию паров высокого давления и поддерживать его горение с минимальным мерцанием.

Внешний источник питания дуговой лампы микроскопа обычно снабжён таймером для отслеживания количества отработанных часов. Дуговые лампы теряют световую отдачу и часто разрушаются при эксплуатации дольше установленного срока службы (200–300 часов). Ртутные лампы не обеспечивают равномерной интенсивности в спектральном диапазоне от УФ до ИК. Максимум их интенсивности приходится на ближний ультрафиолет. Отчётливые пики интенсивности возникают на 313, 334, 365, 406, 435, 546 и 578 нанометрах. На других длинах волн видимого спектра интенсивность стабильна, хотя и не так высока (но всё же достаточна для большинства приложений). Но мощность лампы сама по себе не является определяющим для эффективности освещения параметром. И напротив, существенным параметром, который в первую очередь должен приниматься во внимание, является средняя светимость с учётом яркости источника, геометрии дуги и углового распределения излучения.

Рис. 5.

Дуговые флуоресцентные лампы

В последние несколько лет оптическая микроскопия переживает подъём в применении лазерных источников света, особенно аргоновых ионных и аргоново-криптоновых (ионных) лазеров. Преимущества этих лазеров заключаются в их небольшом размере, малой расходимости пучка, высокой степени монохроматичности и высокой средней светимости. Они получили широкое применение в сканирующей конфокальной микроскопии, которая стала мощным инструментом создания высоко контрастных флуоресцентных изображений за счёт исключения внефокусных засветок, идущих из фокальной плоскости образца. В конфокальных микроскопах это достигается благодаря сканированию образца фокальной точкой или линией с одновременным формированием изображения через сопряжённую апертуру. Оптические срезы образцов могут храниться в памяти компьютера микроскопа и реконструироваться в окончательное изображение, отображаемое на мониторе.

Обозначения фильтров

Общая терминология, принятая для обозначения комбинаций фильтров во флуоресцентной микроскопии, стала весьма запутанной из-за различных аббревиатур и кодов, применяемых разными производителями для маркировки своих фильтров. В принципе, существуют три основных категории фильтров: фильтры возбуждения (часто просто называемые возбудителями), запирающие (эмиссионные) фильтры и дихроичные светоделители (или дихроичные зеркала). Прежде флуоресцентные светофильтры состояли исключительно из цветного стекла или желатина, вставленного между двумя стеклянными пластинами. Однако сегодня имеет место тенденция к производству высокочувствительных фильтров с интерференционной оптикой для пропускания или задержки света строго определённых длин волн, обладающей, к тому же, высоким коэффициентом пропускания. Дихроичные светоделители являются специальными интерференционными фильтрами, предназначенными для отражения или пропускания света определённых длин волн, помещаемых на световом пути под углом 45 градусов (см. рисунки 1и 2). Запирающие фильтры изготавливаются на основе либо цветного стекла, либо интерференционных покрытий (либо их комбинации).

Для обозначения характеристик фильтров возбуждения производителями применяется различная аббревиатура. Ультрафиолетовое стекло, например, обозначается как UG, а синее стекло — BG. На узкополосных фильтрах часто можно встретить обозначение KP (K от немецкого «kurz», что переводится как «короткий») или просто SP. Интерференционные фильтры сейчас маркируются некоторыми производителями аббревиатурой IF. Узкополосные интерференционные фильтры возбуждения особенно эффективны при малом стоксовом сдвиге.

Сокращения и аббревиатуры для запирающих фильтров бывают следующими: LP или L для широкополосных фильтров, Y или GG для жёлтого (от немецкого «gelb» — «жёлтый») стекла, R или RG для красного стекла, OG или O для оранжевого стекла, K для щелевых фильтров (от немецкого «kante» — край), и BA для запирающих фильтров. Если в маркировке фильтра стоит число, как например ВА515, оно обозначает длину волны (в нанометрах), на которой он имеет половину от максимального коэффициента пропускания.

Дихроичные светоделители также маркируются различными аббревиатурами: CBS обозначает хроматический светоделитель, DM — дихроичное зеркало, TK — щелевой делитель (от немецкого «teiler kante»), FT — делитель цвета (от немецкого»farb teiler») и RKP — узкополосный отражатель. Все эти обозначения являются взаимозаменяемыми; кроме того, оптическое стекло всех современных дихроичных светоделителей всегда покрывается интерференционными покрытиями (а не органическими или металлическими красящими веществами). Эти тонкие интерференционные плёнки обладают высоким коэффициентом отражения коротких волн и высоким коэффициентом пропускания длинных волн. Дихроичные светоделители наклонены под углом 45 градусов по отношению свету возбуждения, падающему на оптический блок через флуоресцентный осветитель отражённого света. Их основной функцией является перенаправление определённых (более коротких) возбуждающих волн на объектив и на расположенный за ним образец. Эти специальные фильтры имеют и дополнительные функции, заключающиеся в пропускании более длинных волн флуоресценции к запирающему фильтру и в отражении рассеянного возбуждающего света обратно в направлении лампового блока.

Рис. 6. Среднеполосный фильтр синего возбуждения Nikon B-2E

На рисунке 6 представлены кривые пропускания для комбинации типичных флуоресцентных светофильтров, применяемых в современных микроскопах. Спектр фильтра возбуждения (красная кривая) демонстрирует высокую степень пропускания (приблизительно 75 процентов) в диапазоне от 450 до 490 нанометров с центральной длиной волны (CWL) 470 нанометров. Дихроичное зеркало (жёлтая кривая) отражает волны в спектральном диапазоне фильтра возбуждения, но пропускает, с относительно высоким коэффициентом, более короткие и более длинные волны. Необходимо заметить, что нулевое пропускание дихроичного зеркала соответствует 100 процентному отражению. Отчётливый провал в кривой пропускания между 450 и 500 нанометрами, который соответствует пику отражения, служит для перенаправления волн из полосы пропускания фильтра возбуждения под углом 90 градусов на образец. Последним звеном в этой последовательности является эмиссионный или запирающий фильтр (белая кривая), который пропускает волны в зелёном участке видимого спектра в интервале от 520 до 560 нанометров. Для обеспечения почти полного разделения отражённых и пропущенных волн границы полос отражения и пропускания различных накладываемых друг на друга спектров должны быть как можно круче. Синусоидальная часть кривой спектра дихроичного зеркала, называемая звоном, является результатом процесса нанесения тонких плёнок. Высокая эффективность этой комбинации фильтров — пример значительных успехов в технологии тонких покрытий интерференционных фильтров.

В основе системы условных обозначений, применяемых компанией Nikon, лежат смешанные термины, появившиеся в начале 1990-х годов. В то время все дополнительные комбинации фильтров Nikon производились методом напыления твёрдых покрытий, но сегодня при производстве многих фильтров, применяются передовые методы мягкого покрытия. И хотя мягкие покрытия более чувствительны к влажности и нагреву и требуют более аккуратного (по сравнению с твёрдыми покрытиями) обращения, они демонстрируют более высокие значения оптической плотности и обеспечивают бо?льшую лёгкость в тонкой настройке специфичных полос пропускания. Понимание условных обозначений комбинаций фильтров Nikon позволяет быстро подбирать необходимые фильтры для специфичных флуророфоров.

Первая буква в принадлежащей компании Nikon системе буквенно-цифровых обозначений указывает на область спектра возбуждения (например, UV, V, B, и G являются сокращениями от английских слов «ultraviolet» — ультрафиолетовый, «violet» — фиолетовый, «blue» — синий, и «green» — зелёный, соответственно). Число, следующее за кодировкой спектра возбуждения, обозначает ширину полосы пропускания фильтра возбуждения: 1 соответствует узкополосному возбуждению, 2 — среднеполосному, и 3 — широкополосному возбуждению. И, наконец, одна или несколько букв, следующих за числом, соответствующим ширине полосы возбуждения, обозначают характеристики запирающего фильтра. Буква A указывает на стандартный широкополосный запирающий фильтр с самой низкой длиной волны отсечки, B обозначает широкополосный запирающий фильтр, имеющий более высокую волну отсечки. Обозначение E (от английского «enhanced» — усиленный) в полосовых эмиссионных фильтрах указывает на улучшенные характеристики в смысле сокращения интерференционного взаимодействия разделяемых сигналов. Обозначение E/C указывает на комбинацию мягких интерференционных покрытий, разработанных специально для работы с такими специфическими красителями, как DAPI, FITC, TRITC и техасский красный.

Флуоресцентный световой баланс

Оценка световых потоков в типичном флуоресцентном микроскопе позволяет в общих чертах составить представление об ограничениях, которые неизбежно возникнут при формировании цифровых изображений или при визуальном наблюдении образцов. В качестве источника облучения для нашей оценки возьмём стандартную 75-ваттную ксеноновую дуговую лампу, средняя плотность светового потока которой приблизительно равна 400 канделам на квадратный миллиметр (другие источники представлены в таблице 1). При направлении излучаемого света на 490-нанометровый интерференционный фильтр (с полосой пропускания 10 нанометров и коэффициентом пропускания 75 процентов) через него пройдёт около 2 милливатт выходного потока лампы. После отражения от дихроичного зеркала с коэффициентом 0,9 световой поток в 1,8 милливатт направляется к задней апертуре объектива микроскопа в качестве возбуждающего пучка.

Для объектива кратностью 100х с числовой апертурой 1,4 освещённая область образца составит 12×10•E(-6) квадратных сантиметров, если диаметр поля зрения считать равным приблизительно 40 микрометрам. Тогда световой поток, падающий на образец, будет около 150 ватт на квадратный сантиметр, что соответствует плотности потока 3.6×10•E(20) фотонов на квадратный сантиметр. Таким образом, интенсивность освещения образца примерно в 1000 раз больше интенсивности освещения земной поверхности в обычный солнечный день.

Флуоресцентное свечение при таком световом потоке зависит от поглощательных и эмиссионных свойств флуророфора, его концентрации в образце и длине оптического пути образца. Математически производимая флуоресценция (F) описывается уравнением:

F = σ • Q • I

где σ — сечение молекулярного поглощения, Q — квантовый выход, а I — падающий световой поток, рассчитанный выше. Предполагая, что флюоресцеин является флуророфором с сечением поглощения (σ) 3×10•E(-16) квадратных сантиметров, получаем Q равным 0.99, что приводит к флуоресценции F в 100000 фотонов в секунду на одну молекулу. При концентрации красителя в 1 микромоль на литр, равномерно распределённом в диске диаметром 40 и толщиной 10 микрометров (объём, равный 12 пиколитрам), получаем приблизительно 1.2×10•E(-17) молей красителя или 7,2 миллиона молекул на оптическом пути. При одновременном возбуждении всех молекул скорость флуоресценции составит 7,2×10•E(11) фотонов в секунду (что является произведением F и числа молекул красителя). Возникает вопрос: сколько испущенных фотонов будет зарегистрировано, и как долго может продолжаться такая скорость испускания?

Табл. 1. Плотность световой энергии различных источников света

Лампа	Ток (амперы)	Световой поток (люмены)	Средняя яркость (кд/мм2)	Размер дуги (ВхШ) (миллиметры)
Ртутная лампа      (100 ватт)	5	2200	1700	0.25 x 0.25
Ксеноновая лампа  (75 ватт)	5.4	850	400	0.25 x 0,50
Ксеноновая лампа (500 ватт)	30	9000	3500	0,30 x 0,30
Галогенная лампа с вольфрамовой нитью	8	2800	45	4,2 x 2,3

Эффективность регистрации фотонов определяется эффективностью их собирания и квантовым выходом детектора. Объектив с числовой апертурой 1,4 и стопроцентным пропусканием (что является нереальным условием) имеет максимальную эффективность собирания фотонов, ограниченную углом приёма около 30 процентов. Коэффициент пропускания дихроичного зеркала равен 85 процентам, а запирающего фильтра — 80 процентам. Результирующая эффективность собирания составляет в этом случае 20 процентов или 140 миллиардов фотонов в секунду. Если в качестве детектора взять традиционный прибор с зарядовой связью (ПЗС), его квантовый выход на волне зелёного флюоресцеина (525 нанометров) составит 50 процентов. Таким образом, детектироваться будут 70 миллиардов фотонов в секунду, или около 10 процентов от испускаемых при флуоресценции. Даже идеальным детектором (со 100-процентным квантовым выходом) может улавливаться только около 20 процентов фотонов флуоресценции.

Длительность флуоресцентного свечения зависит от скорости разрушения флуророфоров, являющегося следствием фотообесцвечивания. Измерения показывают, что каждая молекула флюоресцеина в кислородосодержащем солевом растворе до своего разрушения успевает испустить около 36000 фотонов. В безкислородном окружении скорость фоторазрушения сокращается примерно в десять раз. Таким образом, молекула флюоресцеина может дать 360000 фотонов. В совокупности все красители в нашем примере (7,2 миллиона молекул) способны испустить минимум 2,6×10•E(11) и максимум 2,6×10•E(12) фотонов. При скорости испускания одной молекулой 100000 фотонов в секунду (согласно вышеприведённым оценкам), получаем длительность флуоресцентного свечения до фоторазрушения равной от 0,3 до 3 секунд. В случае регистрации 10 процентов от числа испущенных фотонов сигнал детектора будет составлять 7,2×10•E(10) электронов в секунду.

Таким образом, если ПЗС имеет 1000×1000-пиксельную камеру, этот сигнал будет распределён среди одного миллиона светочувствительных элементов, то есть приблизительно по 72000 электронов на каждый из них. Для научно-исследовательского ПЗС с 9-микрометровыми светочувствительными элементами зарядовая ёмкость составляет около 80000 электронов, а шум считывания меньше 10 электронов. В этом случае отношение сигнал-шум будет, в основном, определяться фотонным флуктуационным шумом, равным квадратному корню сигнала, то есть около 268. Почти во всех случаях такой высокий уровень сигнала может продолжаться лишь короткое время, до наступления фоторазрушения. Для продления времени наблюдения большинство микроскопистов сокращает интенсивность облучающего потока, чтобы возбуждалась, а следовательно, и разрушалась только часть из общего числа молекул флуророфора. Таким образом, отношение сигнал-шум редко достигает теоретического максимума и обычно во флуоресцентной микроскопии лежит в диапазоне от 10 до 20.

Детектирование отдельных молекул

В идеальных условиях, часто бывает возможно зарегистрировать флуоресцентное свечение отдельной молекулы, если, конечно, оптический фон и шум детектора достаточно низки. Как говорилось выше, одна молекула флюоресцеина до своего разрушения фотообесцвечиванием может испустить до 300000 фотонов. При 20-процентной собираемости и эффективности детектирования будут зарегистрированы около 60000 фотонов. Применяя для экспериментов такого рода ПЗС на основе лавинных фотодиодов или электронного умножения, исследователям удавалось следить за поведением отдельных молекул в течение секунд и, даже, минут. Главной проблемой в таких случаях является подавление шума оптического фона. Из-за того, что многие материалы, применяемые в конструкции микроскопических линз и фильтров, проявляют определенную автофлуоресценцию, первоначальные усилия были направлены на производство компонентов с малой флуоресценцией. Однако, вскоре стало очевидным, что при использоваии во флуоресцентной микроскопии метода полного внутреннего отражения (ПВО, или TIR в английской аббревиатуре), необходимое сочетание низкого фона и высоко интенсивного потока возбуждающего света может быть достигнуто.

Рис. 7. Конфигурации инвертированного и ФМПВО (TIRF) микроскопов

Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения (ФМПВО или TIRFM в английской аббревиатуре) использует явление нераспространяющейся или быстрозатухающей волны, которая возникает при полном внутреннем отражении на границе двух сред с разными показателями преломления.

Схема с применением внешнего источника света представлена на рисунке 7(а). В этом методе пучок света (обычно расширенный лазерный пучок) проходит через призму с высоким показателем преломления (как у стекла или сапфира), прилегающую либо к стеклу, либо к водному раствору с более низким показателем преломления. Если свет направляется на призму под углом, большим критического, пучок будет полностью отражён от границы раздела. Явление отражения вызывает на поверхности раздела нераспространяющуюся волну, а именно, происходит генерация электромагнитного поля, проникающего в среду с меньшим показателем преломления на расстояние не большее 200 нанометров. Интенсивность света в нераспространяющейся волне достаточна для возбуждения флуророфоров, но из-за её чрезвычайно малой глубины, объём возбуждения очень мал. Результатом этого является низкоуровневый фон, поскольку объём образца, подвергшийся облучению, ничтожно мал (только та его часть, которая находится от поверхности в пределах 200-нанометрового расстояния).

Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения может быть реализована и с использованием модифицированного метода эпи-освещения, применяемого в широкопольной микроскопии (как показано на рисунке 7(b)). Для этого метода требуются объективы с очень высокой числовой апертурой (по крайней мере, 1,4, но желательно — от 1,45 до 1,6) и частичное освещённое поле микроскопа, что достигается с помощью небольшого пятна или, для большей равномерности освещения, тонкого кольца, блокирующего часть светового потока. Для достижения критического угла, за которым наступает полное внутреннее отражение, необходимо, чтобы иммерсионная среда в линзах и покровное стекло микроскопа имели высокий показатель преломления. Как показано на рисунке 7(b), световые лучи, выходящие из передней линзы под углом меньшим критического (на рисунке он обозначен A(1)), уже не возвращаются в микроскоп. При достижении критического угла или его превышении (угол A(2) на рисунке 7(b)) происходит полное внутреннее отражение.

Для получения дополнительной информации при исследованиях, с методом полного внутреннего отражения часто сочетаются другие популярные передовые методы флуоресценции, такие как резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET), восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP), а также спектроскопия. В сочетании, эти методы являются мощным инструментом в изучении отдельных флуророфоров и флуоресцентно окрашенных молекул. Преимущества изучения отдельных молекул только сейчас начинают осознаваться. Таким образом, сегодня диапазон исследований оптической микроскопии — от отдельных молекул до целых животных.

Заключение

Современные флуоресцентные микроскопы сочетают в себе мощь высококачественных оптических компонентов с компьютеризированным управлением и формированием изображений цифровым способом, что позволяет достигать уровня сложности, который далеко превосходит простое визуальное наблюдение. Сегодня микроскопия в значительной степени зависит от электронных способов формирования изображения, позволяющих быстро получать информацию при низких уровнях световых сигналов или на визуально не регистрируемых длинах волн. Эти технические усовершенствования являются не просто элементами внешнего оформления, но существенными компонентами оптического микроскопа, как сложной измерительной системы.

Время, когда оптическая микроскопия было чисто описательной дисциплиной или интеллектуальной игрушкой прошло. Сегодня получение оптического изображения является только первым шагом в анализе данных. Этот первый шаг осуществляется микроскопом в соединении с электронными детекторами, процессорами изображений, дисплеями, которые могут рассматриваться как расширение системы формирования изображений. Применяемое уже повсеместно компьютеризированное управление фокусировкой, положением предметного столика, оптическими компонентами, затворами, фильтрами и детекторами позволяет проводить такие манипуляции во время эксперимента, которые были просто невозможны для человека при работе на механических микроскопах. Все более возрастающее использование оптоэлектроники во флуоресцентной микроскопии привёло к разработке оптических пинцетов для манипулирования субклеточными структурами и частицами, к наблюдению отдельных молекуле, а также к появлению широкого круга сложнейших спектроскопических приложений.

Комбинации флуоресцентных фильтров

Комбинации эпи-флуоресцентных интерференционных и поглощающих фильтров помещаются в фильтр-кубы (или оптические блоки) и включают в себя фильтр возбуждения, дихроичный светоделитель (часто называемый зеркалом) и запирающий (или эмиссионный) фильтр, как показано на рисунке 1(а). Это руководство может быть полезно при подборе комбинации фильтров, соответствующей поглощательным и испускательным спектральным характеристикам хромофоров, применяемых в широкопольной флуоресцентной микроскопии. Спектральные кривые типичной комбинации высокопроизводительных полосовых фильтров в синем диапазоне возбуждения представлены на рисунке 1(b). Комбинации флуоресцентных фильтров компании Nikon поставляются с узкополосными, среднеполосными и широкополосными фильтрами возбуждения и соответствующими им эмиссионными фильтрами с определённой или широкой полосой пропускания.

Рис. 8. Спектральные кривые блока фцлуоресцентных светофильтров

Ультрафиолетовое возбуждение — в набор флуоресцентных фильтров ультрафиолетового возбуждения компании Nikon входят четыре тщательно сбалансированных комбинации, в которые включены обычные полосовые или широкополосные эмиссионные (запирающие) фильтры, способные избирательно пропускать флуоресцентное свечение в узком или широком диапазоне синего, зелёного и красного участков видимого спектра. Эти комбинации фильтров охватывают диапазон возбуждения от 330 до 380 нанометров с шириной полосы пропускания 10, 40 и 50 нанометров. В три комбинации входит одно и то же дихроичное зеркало, а в четвертой оно имеет более низкую волну отсечки для совпадения с узкой полосой возбуждения. Комбинации ультрафиолетовых фильтров включают эмиссионные фильтры либо с заданной, либо с широкой полосой пропускания.

Фиолетовое возбуждение — в набор флуоресцентных фильтров фиолетового возбуждения компании Nikon входят три комбинации, в которые включены обычные полосовые или широкополосные эмиссионные (запирающие) фильтры, способные избирательно пропускать флуоресцентное свечение в узком или широком интервале синего, зелёного и красного участков спектра. Эти комбинации фильтров охватывают диапазон возбуждения от 379 до 420 нанометров с шириной полосы пропускания 10, 22 и 40 нанометров. В две комбинации входит одно и то же дихроичное зеркало, а в третьей оно имеет более низкую волну отсечки для совпадения с полосой возбуждения на более коротких волнах.

Сине-фиолетовое возбуждение — в набор флуоресцентных фильтров сине-фиолетового возбуждения компании Nikon входят четыре комбинации, в которые включены обычные полосовые или широкополосные эмиссионные (запирающие) фильтры, способные избирательно пропускать флуоресцентное свечение в узком или широком интервале голубого, зелёного и красного участков видимого спектра. Эти дополнительные наборы фильтров охватывают диапазон возбуждения от 400 до 446 нанометров с шириной полосы пропускания 10, 20 и 40 нанометров. В три комбинации входит одно и то же дихроичное зеркало, а в четвертой оно имеет более высокую волну отсечки (на 5 нанометров) для соответствия другим компонентам.

Синее возбуждение — набор флуоресцентных фильтров синего возбуждения компании Nikon состоит из шести сбалансированных комбинаций, в которые включены обычные полосовые или широкополосные эмиссионные (запирающие) фильтры, способные избирательно пропускать флуоресцентное свечение в узком или широком интервале зелёного, жёлтого, красного и инфракрасного участков спектра. Эти комбинации фильтров охватывают диапазон возбуждения от 420 до 495 нанометров с шириной полосы пропускания 20, 30, 40 и 70 нанометров. В пять комбинаций входит одно и то же дихроичное зеркало, а в шестой оно имеет более низкую волну отсечки для увеличения принимаемого сигнала. Все полосные запирающие фильтры для фильтрационных наборов синего возбуждения компании Nikon имеют спектральную ширину 40 нанометров. Один из фильтров (B-3A) разработан для применения с освещением галогенной лампой с вольфрамовой нитью.

Зелёное возбуждение — набор флуоресцентных фильтров зелёного возбуждения компании Nikon состоит из шести блоков, в которые включены обычные полосовые или широкополосные эмиссионные (запирающие) фильтры, способные избирательно пропускать флуоресцентное свечение в узком или широком интервале жёлтого, оранжевого, красного и ближнего инфракрасного участков спектра. Эти комбинации фильтров охватывают диапазон возбуждения от 510 до 560 нанометров с шириной полосы пропускания 10, 25, 30 и 50 нанометров (включая узкую, среднюю и широкую полосы возбуждения). В три комбинации входит одно и то же дихроичное зеркало (565 нанометров), а остальные три имеет волну отсечки с большей длиной (570 и 575 нанометров). Два из шести фильтрационных наборов компании Nikon для зелёного возбуждения включают полосовые запирающие фильтры с полосами пропускания 60 и 75 нанометров.

Жёлтое возбуждение — набор флуоресцентных фильтров жёлтого возбуждения компании Nikon состоит из двух сбалансированных комбинаций, в которые включены эмиссионные (запирающие) фильтры с одной определённой полосой пропускания, способные избирательно пропускать флуоресцентное свечение в оранжевом и красном участках спектра. Эти дополнительные комбинации фильтров охватывают диапазон возбуждения от 532 до 587 нанометров с шириной полосы пропускания 40 и 55 нанометров. В обе комбинации входит одно и то же дихроичное зеркало (с отсечкой на 595 нанометрах). Два фильтрационных набора компании Nikon для жёлтого возбуждения включают полосовые запирающие фильтры с полосами пропускания 60 и 75 нанометров.

Красное возбуждение — комбинация флуоресцентных фильтров компании Nikon для красного возбуждения представлена одним блоком, который включает полосовой эмиссионный (запирающий) фильтр, способный избирательно пропускать флуоресцентное свечение в дальнем красном и ближним инфракрасном участках спектра. Середина полосы пропускания запирающего фильтра приходится на 700 нанометров, а её ширина — 75 нанометров (от 663 до 738 нанометров). Широкая 60-нанометровая полоса возбуждения от 590 до 650 нанометров захватывает оранжевые и красные длины волн. В комбинацию Cy5 HYQ входит дихроичное зеркало с отсечкой на 660 нанометрах, что на 10 нанометров больше отсечки полосы возбуждения.

Возбуждение жёлтого флуоресцентного белка (YFP) — для жёлтого флуоресцентного белка компанией Nikon разработана одна высококачественная сбалансированная комбинация, которая расширяет возможности регистрации флуоресцентного белка (обеспеченные тремя фильтрационными наборами для зелёного флуоресцентного белка (GFP)) благодаря использованию фильтров для вариантов GFP с большей длиной волны (YFP и EYFP). В блок фильтров YFP HYQ входят фильтры возбуждения и эмиссионные (запирающие) фильтры с относительно узкой полосой пропускания, разработанные специально для соответствия спектральным характеристикам жёлтого флуоресцентного белка с усиленной флуоресценцией (усиленного YFP), что позволяет оценить флуоресценцию от дериватов YFP отдельно от остальных флуоресцентных белков.

Возбуждение в двух полосах — набор двухполосных флуоресцентных фильтров Nikon состоит из трёх тщательно сбалансированных комбинаций, включающих двухполосные фильтры (возбуждения и эмиссионные (запирающие) фильтры), объединённые в одном блоке, избирательно пропускающем флуоресцентное свечение от двух флуорофоров одновременно. Каждый из фильтрационных блоков оптимально сочетается со специфичной флуорохромной парой, хотя также эффективно может работать и с другими парами флуоресцентных красителей, имеющих те же спектральные профили поглощения и испускания. Благодаря точному подбору полос, с крутыми межполосными переходами между участками отражения и пропускания, различные сигналы возбуждения и испускания разделяются с минимально перекрывающейся интерференцией.

Возбуждение в трёх полосах — трёхполосные флуоресцентные фильтры Nikon представлены двумя сбалансированными блоками, включающими трёхполосные фильтры (возбуждения и эмиссионные (запирающие) фильтры), избирательно пропускающие флуоресцентное свечение от трёх флуорофоров одновременно. Каждый из фильтрационных блоков оптимально сочетается со специфичным набором из трёх флуорохромов, хотя также эффективно может работать и с другими комбинациями красителей, имеющих те же спектральные профили поглощения и испускания. Благодаря точному подбору полос, с крутыми межполосными переходами между участками отражения и пропускания, различные сигналы возбуждения и испускания разделяются с минимальной интерференцией между ними. Тройные кубы.

HYQ кубы — HYQ комбинации флуоресцентных фильтров Nikon представлены четырьмя тщательно сбалансированными высококачественными блоками, каждый из которых включает полосные эмиссионные (запирающие) фильтры для избирательного пропускания флуоресценции в пределах ограниченного диапазона. В обозначении каждого HYQ-фильтра отражено название флуорохрома, для которого он был разработан, но в пределах своих диапазонов возбуждения каждая комбинация может применяться для наблюдения различных флуорохромов с соответствующими характеристиками.

Базовый список блоков флуоресцентных фильтров Nikon

В основе системы условных обозначений, применяемых компанией Nikon, лежат смешанные термины, появившиеся в начале 1990-х годов. В то время все дополнительные комбинации фильтров Nikon производились методом напыления твёрдых покрытий, но сегодня при производстве многих фильтров, применяются передовые методы мягкого покрытия. И хотя мягкие покрытия более чувствительны к влажности и нагреву и требуют более аккуратного (по сравнению с твёрдыми покрытиями) обращения, они демонстрируют более высокие значения оптической плотности и обеспечивают бо?льшую лёгкость в тонкой настройке специфичных полос пропускания. Понимание условных обозначений комбинаций фильтров Nikon позволяет быстро подбирать необходимые фильтры для специфичных флуророфоров.

Первая буква в принадлежащей компании Nikon системе буквенно-цифровых обозначений указывает на участок спектра возбуждения (например, UV, V, B, и G являются сокращениями от английских слов «ultraviolet» — ультрафиолетовый, «violet» — фиолетовый, «blue» — синий, и «green» — зелёный, соответственно). Число, следующее за кодировкой спектра возбуждения, обозначает ширину полосы пропускания фильтра возбуждения: 1 соответствует узкополосному возбуждению, 2 — среднеполосному, и 3 — широкополосному возбуждению. И, наконец, одна или несколько букв, следующих за числом, соответствующим ширине полосы возбуждения, обозначают характеристики запирающего фильтра. Буква A указывает на стандартный широкополосный запирающий фильтр с самой низкой длиной волны отсечки, B обозначает широкополосный эмиссионный фильтр, имеющий более высокую волну отсечки. Обозначение E (от английского «enhanced» — усиленный) в полосных эмиссионных фильтрах указывает на улучшенные характеристики в смысле сокращения интерференционного взаимодействия разделяемых сигналов. Обозначение E/C указывает на комбинацию мягких интерференционных покрытий, разработанных специально для работы с такими специфическими красителями, как DAPI, FITC, TRITC и техасский красный.

Press-room — IBCh RAS

Объявления →

• science news Conformational changes in the receptor tyrosine kinase IRR during activation were determined April 5

  Researchers of the Laboratory of Receptor Cell Biology IBCh RAS together with colleagues from the IPCE RAS and IC RAS carried out a study of the IRR structure by atomic force microscopy and small-angle X-ray scattering. The conformations of the receptor in the active and inactive states have been determined; on the basis of the obtained data, an activation mechanism has been proposed.

• science news The role of natural mutations of the human protein SLURP-1 in the pathogenesis of Mal de Meleda skin disease has been determined March 29

  Mal de Meleda (MDM) is recessively inherited palmoplantar keratoderma associated with mutations in a gene encoding SLURP-1 protein. SLURP-1 is a paracrine regulator of keratinocyte homeostasis interacting with the α7 type nicotinic acetylcholine receptor (α7-nAChR). This receptor participates in control of growth, terminal differentiation, apoptosis and cornification of keratinocytes. Dysregulation of the α7-nAChR function due to SLURP-1 deficiency or point mutations of this protein may underlie MDM pathogenesis.

• science news Genomic DNA i-motifs as fast sensors responsive to near-physiological pH microchanges January 4

  Researchers from Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical medicine and Institute of Bioorganic Chemistry RAS, in collaboration with Skolkovo University of Science and Technology and D.Mendeleev University of Chemical Technology of Russia developed simple and robust sensors for detecting microchanges in intracellular pH.

• science news From cytoskeleton to pluripotency: a new mechanism for regulating stem status of the embryonic cells November 17, 2020

  Researchers from the Laboratory of Molecular Bases of Embryogenesis (Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS), in technical cooperation with colleagues from the Department of Metabolism and Redox Biology (Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS), the Laboratory of Genomics and Epigenomics of Vertebrates in the Federal Center «Fundamentals of Biotechnology» RAS, as well as with colleagues from the Cell Motility Group of the Institute of Protein Research RAS, discovered a previously unknown mechanism of the regulation of the activity of genes that determine the pluripotent status of the embryonic stem cells.

• science news Dual Targeting of Cancer Cells with DARPin-Based Toxins for Overcoming Tumor Escape November 17, 2020

  Researchers of the Laboratory of Molecular Immunology, IBCh RAS, in collaboration with Russian colleagues have shown that the strategy of targeting of anticancer toxins to two different surface antigens on the surface of a cancer cell is effective in the treatment of not only primary solid tumors, but also distant metastases.

• science news Liquid drop of DNA libraries reveals total genome information October 22, 2020

  Unlike the tightly controlled replication of DNA in living cells, PCR amplification, a “workhorse” of molecular biology, balances between simplicity and accuracy. Conventional “bulk” PCR often yields inefficient and nonuniform amplification of complex templates in DNA libraries, introducing unwanted biases.

• science news Discovery of the novel protein encoded in mammalian mitochondrial DNA polymerase gene POLG September 25, 2020

  Researchers from Laboratory of bioinformatics approaches in combinatorial chemistry and biology and Laboratory of high-performance screening of biological objects together with colleagues from Moscow State University and University College Cork (Ireland) discovered novel protein POLGARF, which is encoded in alternative reading frame of mitochondrial DNA polymerase POLG mRNA. The results of this study are published in PNAS.

• science news Multiscale computation delivers organophosphorus reactivity and stereoselectivity to immunoglobulin scavengers September 10, 2020

  The scientists from the Laboratory of biocatalysis, the Laboratory of proteolytic enzyme chemistry, the Laboratory of bioinformatics approaches in combinatorial chemistry and biology and the Laboratory of hormonal regulation proteins, together with colleagues from EMBL-Hamburg, Moscow State University. M.V. Lomonosov, the Sheffield Institute and the Scripps Research Institute have developed a universal algorithm that makes it possible to create biological antidotes based on biocatalysts, directionally increasing their reactivity, and to predict stereoselectivity.

• science news The discovery of four genes of the Noggin family in lampreys is consistent with the hypothesis of two rounds of genomic duplications in vertebrate ancestors September 10, 2020

  Researchers from the Laboratory of Molecular Bases of Embryogenesis, together with a colleague from the Severtsov Institute of Ecology and Evolution, described for the first time four genes of the Noggin family in the oldest representatives of vertebrates — lampreys, and compared their structure, expression and some functional features with those of the known genes of this family in other vertebrates.

• science news A versatile platform for bioimaging based on colominic acid-decorated upconversion nanoparticles September 3, 2020

  Scientists from the IBCh RAS, Federal Scientific Research Centre “Crystallography and Photonics”, FSBSI “N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center”, Lomonosov Moscow State University of Fine Chemical Technologies and Sechenov First Moscow State Medical University developed a method for the UCNP surface functionalization with endogenous colominic acid conferring “stealth” properties, which led to effective accumulation in the area of inflammation, as well as micro- and macro-blood vessels visualization.

• conferences International School «Molecular mechanisms of neurodegenerative diseases» November 26, 2020 (This event is over)

  Moscow Institute of Physics and Technology (MIPT) invites you to take part in the International school for young scientists «Molecular mechanisms of neurodegenerative diseases», which will be held on November 26, 2020 online.

• science news Lecture by Director-General of the ICGEB Lawrence Banks «Human Papillomaviruses: From Infectious Entry to Malignancy» January 27, 2020 (This event is over)

  ICGEB Director-General Group Leader Lawrence Banks will deliver a lecture entitled «Human Papillomaviruses: From Infectious Entry to Malignancy».  Date and time: Mon 27 January 2020 14:00. Location: Small conference hall at 3rd floor BON IBCh.

• science news LIGHTS ON: Molecular Imaging of disease dynamics in vivo September 27 — October 11, 2019 (This event is over)

  Abhijit De PhD Scientific Officer ‘F’ and Principal Investigator Head, Molecular Functional Imaging Lab Advanced Centre of Training Research and Education in Cancer, Tata Memorial Centre, Kharghar, Navi Mumbai, India.

• science news Seminar «Molecular Brain»: Anton Maximov October 8, 2019 (This event is over)

  The seminar will be held on the 8th of October at 3 pm in the Small lecture hall (3rd floor, BON, IBCh). Everyone is welcome!

• conferences II Joint Life Sciences Forum: VI Russian Congress on Biochemistry and IX Russian Symposium «Proteins and Peptides» October 1–6, 2019 (This event is over)

  Dear Colleagues! We are pleasure to invite you to participate the VI Russian Congress on Biochemistry, which will be held in Sochi, Russia (Dagomys Hotel) on October 1-6, 2019.

• science news Lecture by Prof. Yibo Wang «Drug Discovery Targeting Transmembrane Protein-Protein Interactions» August 26, 2019 (This event is over)

  Prof. Yibo Wang from the Changchun Institute of Applied Chemistry will deliver a lecture entitled «Drug Discovery Targeting Transmembrane Protein-Protein Interactions». Date and time: Mon 26 August 2019 11:30. Location: Conference hall at 5th floor BON IBCh.

• conferences 12th INTERNATIONAL CONFERENCE “BIOCATALYSIS.FUNDAMENTALS & APPLICATIONS” “BIOCATALYSIS-2019” June 24–28, 2019 (This event is over)

  Dear colleagues, The Lomonosov Moscow State University and RAS institutes, including IBCH RAS, is planning to convene a traditional biannual 12 th International Conference «BIOCATALYSIS-2019» in June, 24–28, 2019. Conference will be convened on board a ship cruising via the route St. Petersburg – Valaam – Kizhi – St. Petersburg. More info is available at http://bc2019.org/.

• science news Scientific School for young scientists «Structural biology: main problems and approaches to their solution» June 6, 2019 (This event is over)

  Dear colleagues! The Scientific School is devoted to the latest achievements and methods in the field of structural research will be held at the IBCh RAS on Thursday, 6 June 2019. The scientific program of the School includes lectures by leading scientists working in various fields of molecular biology and representing the basic structural methods, namely, X-ray Crystallography, Cryo-Electron Microscopy, NMR-spectroscopy and computer modeling.

• science news «Molecular Brain» seminar April 16, 2019 (This event is over)

  The seminar is timed to the birthday of academician Eugene Grishin and will take place on April 16 at 14:00 in the Hall of Academic Council. Members of the Department of Molecular Neurobiology created by Eugene, will give talks on their present work. Everyone is cordially invited.

• science news Microscopic Imaging of Epigenetic Landscape — A Universal Platform to Study Epigenetic Changes at Single Cell Level February 15, 2019 (This event is over)

Наборы для флуоресцентного мечения антител

Наборы позволяют быстро ввести флуорофоры (флуоресцентные красители) в состав антитела (2-3 метки на 1 молекулу белка). В набор входят компоненты для проведения 10 реакций x 100 мкг антитела. Принцип действия основан на использовании сукцинимидного эфира красителя (берется в избытке), который в слабощелочной среде реагирует со свободными аминогруппами антитела (N-концевой аминогруппой, аминогруппой на лизине). Последующая очистка антитела от непрореагировавшего реагента производится гель-фильтрацией на микроколонках (входят в набор). Для мечения используются полностью растворимые в воде красители, поэтому наборы отлично подходят для мечения белков, в том числе антител.

Состав набора

Компонент набора	Количество
	1321-10rxn 10 реакций	3321-10rxn 10 реакций	7321-10rxn 10 реакций	5321-10rxn 10 реакций	6321-10rxn 10 реакций
N1320, Sulfo-Cyanine3 активированный эфир, 1 rxn	10	—	—	—	—
N3320, Sulfo-Cyanine5 активированный эфир, 1 rxn	—	10	—	—	—
N7320, Sulfo-Cyanine5.5 активированный эфир, 1 rxn	—	—	10	—	—
N5320, Sulfo-Cyanine7 активированный эфир, 1 rxn	—	—	—	10	—
N6320, sulfo-Cyanine7.5 активированный эфир, 1 rxn	—	—	—	—	10
Спин-колонка для обессоливания, PBS	10	10	10	10	10
Пробирка приемная для обессоливания, 1.5 мл	10	10	10	10	10
Пробирка приемная без крышки, 2 мл	10	10	10	10	10
Таблетка PBS, на 100 мл буфера	1	1	1	1	1
15050, ДМСО, для мечения, 1 mL	1	1	1	1	1
1584-05mL, Раствор азида натрия, 3%, 0.5 mL	1	1	1	1	1
1689-15mL, Гидрокарбонат натрия, 126 mg	1	1	1	1	1

Хранить при температуре от +3 °C до +20 °C. Не замораживать!

Срок хранения 12 месяцев.

Протокол

1. Подготовка антитела.

Препарат антитела не должен содержать примеси свободных аминокислот или других белков, например BSA, а также компонентов буферных растворов с pH 2-7,5 или 9-12. Если антитело находится в буферном растворе с pH 8- 8,5 (на основе бикарбоната натрия или TrisHCl) и гарантированно не содержит других примесей, его можно использовать в реакции без дополнительной очистки. Если вы не уверены, что препарат антитела не содержит примесей, то обязательно проведите процедуру очистки. Для очистки антитела (при необходимости) рекомендуется использовать один из следующих методов: диализ, гель-фильтрация или ультрафильтрация на колонках, с использованием 0.1 М раствора гидрокарбоната натрия (навеска гидрокарбоната натрия есть в наборе).

Оптимальные условия для проведения мечения антитела: концентрация антитела 1 мг/мл в растворе 0.1 М гидрокарбоната натрия без посторонних примесей. Присутствие консервирующего агента азида натрия в растворе антитела (до концентрации 0.04%) не оказывает влияния на реакцию.

Если концентрация антитела ниже 1 мг/мл, то ее необходимо довести до 1 мг/мл с помощью концентрирования (ультрафильтрацией) и последующего разбавления. Для полной очистки от возможных примесей рекомендуется провести два цикла концентрирования/разбавления. После каждого концентрирования антитело разбавляется 0.1 М гидрокарбонатом натрия.

Если концентрация антитела выше 1 мг/мл, перед разбавлением рекомендуется провести его однократную промывку на колонке для ультрафильтрации с помощью 0.1 М гидрокарбоната натрия. Для полной очистки от возможных примесей рекомендуется провести два цикла концентрирования/разбавления. После промывки антитело разбавляется 0.1 М гидрокарбонатом натрия.

Концентрацию антитела рекомендуется контролировать спектрофотометрически (для этих целей лучше всего подходит бескюветный спектрофотометр).

Стоит отметить, что концентрация антитела в реакционной смеси влияет на степень мечения. Например, при постановке реакции со 100 мкг антитела в объеме менее 100 мкл будет получено модифицированное антитело со степенью мечения до 4-5 молекул красителя на антитело. При постановке реакции со 100 мкг антитела в объеме, большем 100 мкл, будет получено модифицированное антитело со степенью мечения 0.3-1 молекул красителя на антитело.

2. Постановка реакции.

2.1. В пробирку с лиофилизованным флуорофором (флуоресцентным красителем) добавьте раствор антитела в 0.1 М гидрокарбонате натрия (рекомендуемые количества — 100 мкг* антитела в 100 мкл**), перемешайте на вортексе до полного растворения реагента и инкубируйте 30 мин при комнатной температуре.

* если необходимо провести реакцию с меньшим количество антитела, необходимо развести лиофилизованный реагент в 10 мкл безводного DMSO и взять для реакции по 1 мкл раствора на каждые 10 мкг антитела. Раствор реагента в DMSO не подлежит хранению.

3. Очистка антитела от избытка реагента.

3.1. Предварительно растворите таблетку буфера PBS в 100 мл воды.

3.2. Подготовьте колонку. Убедитесь, что колонка имеет комнатную температуру. Сорбент ресуспендируйте на вортексе. Снимите с колонки колпачки, поместите ее в пробирку для сбора жидкости и центрифугируйте получившуюся конструкцию 2 мин при 1000 g (необходимо строго соблюдать установленную скорость; для стандартного ротора радиусом 6 см, 1000 g соответствует 3800 об/мин; при центрифугировании необходимо соблюдать ориентацию колонки в роторе: выступ на верхней части колонки должен быть направлен от центра ротора). После центрифугирования удалите фильтрат.

3.3. Нанесите на колонку 400 мкл буфера PBS, центрифугируйте 2 мин при 1000 g. После центрифугирования удалите фильтрат. Перенесите колонку в 1,5 мл пробирку для сбора антитела, входящую в набор.

3.4. Нанесите в центр колонки 100 мкл** реакционной смеси, инкубируйте 1 мин, центрифугируйте в течение 2 мин при 1000 g. В пробирке соберется очищенное антитело***.

**Для очистки на колонку можно наносить от 50 до 100 мкл. Если реакция проводилась в меньшем объеме, рекомендуется после реакции довести объем препарата минимум до 50 мкл путем добавления буфера PBS.

***После центрифугирования к препарату антитела можно добавить раствор азида натрия (имеется в наборе) в объеме 1% от объема препарата. При необходимости препарат антитела можно разделить на аликвоты по мере центрифугирования. В этом случае аликвоту, с которой ведется работа, следует хранить при +4 °С, остальные аликвоты — при −20 °С. При +4 °С допустимо хранить только те растворы, в которые добавлен азид натрия.

4. Контроль количества флуорофоров, прореагировавших с антителом.

Для того чтобы вычислить степень мечения (число молекул флуорофора, введенных на 1 молекулу антитела), необходимо измерить оптическую плотность раствора при длине волны 280 нм (A_AB) и длине волны максимума поглощения красителя (A_dye). Типичный вид спектра поглощения показан на рисунке. В зависимости от красителя длина волны максимума его поглощения может меняться.

В спектре поглощения меченого антитела присутствует пик красителя (длинноволновый), и пик поглощения антитела (~280 нм). Число молекул флуорофора на 1 молекулу антитела рассчитывается по формуле:

где Dye/AB — искомое число молекул красителя на молекулу антитела, A_dye — оптическая плотность образца на длине волны максимума поглощения красителя, A_AB — оптическая плотность образца на длине волны 280 нм, ε_AB — мольный коэффициент экстинкции антитела на длине волны 280 нм (для IgG — 210000), ε_Dye — мольный коэффициент экстинкции красителя на длине волны максимума поглощния (берется из таблицы ниже), CF₂₈₀ — фактор коррекции для красителя на длине волны 280 нм (берется из таблицы ниже).

Краситель	λmax, нм	ε	CF280
sulfo-Cyanine3	548	162 000	0.06
sulfo-Cyanine5	646	271 000	0.04
sulfo-Cyanine5.5	673	195 000	0.11
sulfo-Cyanine7	750	240 600	0.04
sulfo-Cyanine7.5	778	222,000	0.09

Пример расчета

В ходе реакции мечения антитела IgG красителем sulfo-Cyanine5 после очистки был получен препарат, имеющий спектр поглощения на рисунке выше. Определить степень мечения антитела.

По спектру поглощения находим A_dye = 0.184 на длине волны максимума поглощения красителя (646 нм, см. таблицу), A_AB = 0.066 (на длине волны 280 нм). ε_AB = 210000 для IgG, из таблицы берем ε_Dye = 271000 и CF₂₈₀ = 0.04.

Dye/AB — искомое число молекул красителя на молекулу антитела — составляет 2.43 молекулы флуорофора на антитело.

Интерпретация результатов и хранение антител

Оптимальная степень мечения для получения хорошего флуоресцентного сигнала составляет в большинстве случаев 2-3 молекулы красителя на молекулу антитела. Дальнейший рост степени мечения не приводит к существенному усилению флуоресцентного сигнала, поскольку наблюдается концентрационное тушение флуоресценции. Если степень мечения недостаточна, необходимо уменьшить количество антитела, вводимого в реакцию. Низкая степень мечения может быть связана с использованием набора с истекшим сроком годности.

Антитела после мечения желательно протестировать на предмет их связывания с субстратом. Хранить меченые антитела можно при −20 °С. Аликвоту, с которой ведется работа, необходимо хранить при +4 °С во избежание многократного замораживания-оттаивания. Стабильность конъюгатов определяется стабильностью самого антитела, а не флуорофора. Не следует хранить меченые антитела на прямом солнечном свету, однако они вполне совместимы с комнатным освещением.

Наборы

Набор для мечения антител, краситель sulfo-Cyanine3

Готовый набор для мечения антител (и других белков подобного размера) красителем sulfo-Cyanine3 в форме активированного эфира. Набор содержит все необходимые реагенты и расходные материалы.

Показать цены

Спрятать цены

Артикул	Фасовка	Цена	Срок поставки	Купить товар
1321-10rxn	10 rxn	23900.00₽	в наличии

---

---

---

---

---

Введено некорректное число товаров для добавления.

Лаборатория флуоресцентного биоимиджинга

Допсоглашение № 2 от 1 марта 2013 года к проекту № 11.G34.31.0017 от 24 ноября 2010 г. — 2013-2014 г.г.

ОРГАНИЗАЦИЯ И ПРОВЕДЕНИЕ IV МЕЖДУНАРОДНОГО СИМПОЗИУМА «TOPICAL PROBLEMS OF BIOPHOTONICS -2013»

IV Международный симпозиум «Актуальные проблемы биофотоники» проходил с 21 по 27 июля 2013 г. в Нижнем Новгороде. Организаторами симпозиума являлись Институт прикладной физики РАН, Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Нижегородская государственная медицинская академия, компания ГИКОМ и ООО «Квантрон—НН».

Симпозиум объединил три тематические конференции: «Оптическийбиоимиджинг», «Нанобиофотоника», «Нейробиофотоника» и семинары — «Современные приложения лазеров в биомедицине», «Клиническая биофотника», «Биофотоника в исследовании стволовых клеток и биологии развития» и «Новое поколение Биофотоники в биологии, фармакологии и медицине». Программа симпозиума включала пленарные, устные и стендовые доклады. Рабочим языком симпозиума был английский.

Общая цель симпозиума – представить современное состояние исследований, концепции и перспективы развития методов и подходов биофотоники при изучении биологических объектов и человека.

Всего в симпозиуме принимало участие 209 человек из 23 стран мира. Было представлено 162 доклада, из них 11 пленарных, 67 приглашенных, 44 устных инициативных, 40 стендовых.

Среди участников конференции было 22 члена творческого коллектива лаборатории «Флюоресцентного биоимиджинга», все они были авторами и соавторами докладов. 20 членов творческого коллектива выступили на симпозиуме с научными докладами. Всего было 26 докладов с участием сотрудников творческого коллектива лаборатории.

Список научных докладов, представленных членами творческого коллектива лаборатории «Флюоресцентного биоимиджинга»:

1. Sergey Deyev. THERANOSTICS: MULTIFUNCTIONAL AGENTS FOR DIAGNOSTICS AND THERAPY (Plenary)
2. M.V. Shirmanova, L.B. Snopova, E.O. Serebrovskaya, M.M. Kuznetsova, E.A. Sergeeva, V.A. Kamensky, D.B. Uzhakova, K.A. Lukyanov, S.A. Lukyanov, and E.V. Zagaynova. IN VIVO STUDY OF GENETICALLY ENCODED PHOTOTOXIC PROTEINS FOR TUMOR THERAPY (Invited)
3. N.Y. Shilyagina, M.A. Sayfullaeva, A.I. Gavrina, I.V. Balalaeva, M.V. Shirmanova, E.V. Zagaynova, L.G. Klapshina, S.A. Lermontova, and A.V. Yakimansky. STUDY OF NOVEL PHOTOSENSITIZERS BASED ON THE CYANOPORPHYRAZINE CHROMOPHORS INCORPORATED INTO BIOCOMPATIBLE POLYMERIC BRUSH NANOPARTICLES
4. L.G. Klapshina, M.K. Kuimova, I.V. Balalaeva, A.V. Yakimansky, M. A. Izquierdo, S.A. Lermontova, N.Yu. Lekanova, I.S. Grigoryev, T.K. Meleshko, M.V. Shirmanova, and E.V. Zagaynova. NOVEL FLUORESCENT PORPHYRAZINE MACROCYCLES AS FUNCTIONAL VISCOSITY PROBES IN LIVE CELLS
5. A.S. Mishin, N.V. Povarova, K.S. Sarkisyan, M.S. Baranov, and K.A. Lukyanov.RATIONAL SELECTION OF BACTERIAL PROTEINS FOR SPECIFIC BINDING OF FLUOROGENIC CHROMOPHORES 6. K.S. Sarkisyan, A.S. Goryashchenko, A.P. Savitsky, K.A. Lukyanov, and A.S. Mishin. A BRIGHT MONOMERIC GREEN FLUORESCENT PROTEIN WITH A FLUORESCENCE LIFETIME OF 5.0 ns
7. N.M. Mishina, I. Bogeski, S. Lukyanov, and V.V. Belousov. IMAGING PIP3 AND h3O2 WITH ONE GENETICALLY ENCODED FLUORESCENT SENSOR
8. A.S. Belova, Е.А. Sergeeva, А.А. Brilkina, N.М. Mishina, А.G. Orlova, А.V. Maslennikova, E.V. Zagaynova, N.M. Shakhova, V.V. Belousov, and S.A. Lukyanov. USE OF GENETICALLY ENCODED SENSOR HYPER FOR STUDYING HYDROGEN PEROXIDE IMPLICATION IN THE MECHANISM OF CISPLATIN ACTION
9. N.V. Klementieva, M.V. Shirmanova, E.O. Serebrovskaya, A.F. Fradkov, N.N. Prodanets, L.B. Snopova, A.V. Meleshina, and E.V. Zagaynova. IN VIVO BIOLUMINESCENCE IMAGING OF TUMOR CELLS USING FIREFLY LUCIFERASE LUC2
10. L.B. Snopova, N.N. Prodanets, M.V. Shirmanova, M.M. Kuznetsova, S.A. Lukyanov, and E.V. Zagaynova. PATHOMORPHOLOGICAL CHANGES IN THE TUMORS INDUCED BY PDT WITH GENETICALLY ENCODED PHOTOSENSITIZERS
11. D.O. Ellinsky, M.Yu. Kirillin, I.L. Shlivko, P.D. Agrba, E.A. Sergeeva, L.B. Snopova, and V.A. Kamensky. IDENTIFICATION OF STRUCTURAL LAYERS OF THICK AND THIN SKIN IN OCT-IMAGES
12. M. Karabut, E. Kiseleva, N. Gladkova, F. Feldchtein, O. Baskina, L. Snopova, and E. Sergeeva. LASER PATTERNED MICROCOAGULATION FOR ORAL TISSUES TREATMENT
13. A.I. Pavlikov, V.V. Elagin, V.I. Yusupov, M.V. Shirmanova, and V.A. Kamensky.IN VITRO INVESTIGATION OF LASER-INDUCED HYDRODYNAMICS ON TUMOR CELLS
14. I.N. Druzhkova, M.M. Kuznetsova, M.V. Shirmanova, L.B. Snopova, N.N. Prodanetz, V.V. Belousov, and E.V. Zagaynova. MEASURING OF pH IN TUMOR XENOGRAFTS USING NEW GENETICALLY ENCODED SENSOR
15. D.S. Kuznetsova, A.V. Meleshina, E.I. Cherkasova, M.V. Shirmanova, and E.V. Zagaynova. 3D-TUMOR SPHEROIDS AS A MODEL FOR TESTING PHOTODYNAMIC THERAPY WITH GENETICALLY ENCODED PHOTOSENSITIZERS
16. Е.V. Gubarkova, N.D. Gladkova, Е.G. Sharabrin, I.V. Balalaeva, L.B. Snopova, Е.B. Kiseleva, М.М. Karabut, and M.Yu. Kirillin. ASSESSMENT OF THE «VULNERABLE» ATHEROSCLEROTIC PLAQUE STRUCTURE WITH CROSS-POLARIZATION OPTICAL COHERENCE TOMOGRAPHY (CP-OCT)
17. Elena Kiseleva, N.D. Gladkova, F.I. Feldchtein, E.A. Sergeeva, M.Yu. Kirillin, I.V. Balalaeva, O.S. Streltzova, and N.S. Robakidze. In vivo evaluation of the depolarizing properties of connective tissue stroma in human mucosa with CP OCT.
18. M.Yu. Kirillin, E.A. Sergeeva, P.D. Agrba, E.B. Kiseleva, E.V. Gubarkova, D.O. Ellinsky, I.L. Shlivko, N.D. Gladkova, O.G. Panteleeva, and N.M. Shakhova. INTERPRETATION OF OCT IMAGES IN BIOTISSUE DIAGNOSTICS: NUMERICAL SIMULATION AND ANALYSIS (Invited)
19. A.V. Maslennikova, A.G. Orlova, G.Yu. Golubjatnikov, N.G. Golubjatnikova, T.I. Pryanikova, S.S. Kuznetsov, V.I. Plekhanov, E.G. Ovchinnikova, E.A. Shakleyina, N.M. Shakhova, and I.V. Turchin. OPTICAL METHODS FOR PREDICTION OF THE EFFECT OF NEOAJUVANT CHEMOTHERAPY OF BREAST CANCER (Invited)
20. M.V. Kochueva, V.A. Kamensky, N.Yu. Ignatjeva, O.L. Zakharkina, S.S. Kuznetsov, E.B. Kiseleva, K. Babak, and A.V. Maslennikova. COMPREHENSIVE STUDY OF RADIATION DAMAGE OF EXSTRACELLULAR MATRIX OF BIOLOGICAL TISSUE
21. T.I. Pryanikova, A.V. Maslennikova, A.G. Orlova, G.Yu. Golubyatnikov, L.B. Snopova, S.S. Kuznetsov, and I.V. Turchin. INFLUENCE OF IRRADIATION ON THE OXYGENATION OF EXPERIMENTAL TUMOR ESTIMATED BY DIFFUSE OPTICAL SPECTROSCOPY
22. P. Subochev, A. Katichev, A. Morozov, A. Orlova, V. Kamensky, and I.Turchin. SIMULTANEOUS PHOTOACOUSTIC AND OPTICALLY MEDIATED ULTRASOUND MICROSCOPY FOR BIMODAL BIOIMAGING OF FUNCTION AND STRUCTURE
23. V.V. Elagin, E.A. Sergeeva, M.L. Bugrova, D.V. Yuzhakova, V.A. Nadtochenko, and E.V. Zagaynova.THE INTRACELLULAR DISTRIBUTION OF GOLD NANOPARTICLES STABILIZED BY VARIOUS AGENTS
24. M.A. Sirotkina, N.N. Prodanets, L.B. Snopova, V.V. Elagin, and E.V. Zagaynova. MORPHOLOGICAL ANALYSIS OF THE NANOPARTICLES-LABELED TUMORS AFTER LASER TREATMENT
25. K.E. Mironova, G.M. Proshkina, A.V. Ryabova, T.A. Zdobnova, and S.M. Deyev. PHOTO-INDUCED CYTOTOXIC EFFECT OF 4D5scfV-miniSOG ON HER2/neu-OVEREXPRESSING CELLS
26. A.V. Meleshina, E.I. Cherkasova, E.A. Sergeeva, E.V. Kiseleva, E.B. Dashinimaev, M.V. Shirmanova, and E.V. Zagaynova. FLUORESCENT IMAGING MODALITIES FOR MESENCHYMAL STEM CELL-TUMOR TROPISM

5 членов творческого коллектива вошли в состав организационного комитета симпозиума:

• Загайнова Е.В. – председатель конференции «Нанобиофотоника»
  
• Лукьянов С.А. – член программного комитета конференции «Нанобиофотоника»
  
• Деев С.М. – член программного комитета конференции «Нанобиофотоника»
  
• Ширманова М.В. – ученый секретарь конференции «Нанобиофотоника»
  
• Турчин И.В. – ученый секретарь конференции «Оптический биоимиджинг»
  

Научная тематика симпозиума имеет прямое отношение к исследованиям, проводимым в рамках проекта. В частности, в рамках конференции ««Нанобиофотоника» была организована специальная секция «Флуоресцентные белки».

На этой секции были представлены устные доклады, раскрывающие природу флуоресценции белков, их фотобиологичекие свойства, перспективы применения для биомедицинских приложений.Интерес аудитории вызвал доклад Марины Ширмановой (Нижегородская медицинская академия) об изучении фототоксичных белков KillerRed и MiniSOG для терапии опухолей, в котором были показаны результаты серии исследований на опухолях животных.Результаты патоморфологического анализа опухолей, подверженных фотодинамической терапии с генетически-кодируемыми белковыми фотосенсибилизаторами, были продемонстрированы в стендовом докладе Сноповой Л.Б. (Нижегородская медицинская академия). Тему фототоксичных белков в стендовой сессии продолжил доклад Мироновой К.Е. (ИБХ РАН) о цитотоксических эффектах конъюгатов белка miniSOG с мини-антителами 4D5scfV. Направление генетически-кодируемых фотосенсибилизаторов является новым в фотодинамической терапии, и по результатам обсуждения докладов на эту тему можно сделать заключение о перспективности данного подхода и целесообразности продолжения исследований в этом направлении.

Доклад Александра Мишина (Нижегородская медицинская академия, ИБХ РАН) был посвящен новому подходу к выбору бактериальных белков для связывания с флуорогенными хромофорами. Работа показала сложность задачи и оригинальность предложенного автором метода.

Большое внимание было уделено теме разработке новых флуоресцентных белков для FRET и FLIMимиджинга: доклады Марии Хреновой (ИБХ РАН), Карена Саркисяна (ИБХ РАН), Виктории Жердевой (ИНБИ РАН). Имиджинг на разном уровне организации от субклеточного до организменного, основанный на регистрации времени жизни флуоресцирующих молекул, переживает в настоящее время интенсивное развитие, как в плане технических разработок, так и создания новых флуоресцирующих агентов. Сообщения на эту тему были сделаны на высоком уровне и подчеркнули актуальность данной темы.

Стендовые доклады Дружковой И.Н. (Нижегородская медицинская академия), Беловой А.С. (ННГУ), Мишиной Н.М. (Нижегородская медицинская академия, ИБХ РАН) были посвящены генетически-кодируемым сенсорам и их использованию для регистрации pH и пероксида водорода в клетках. Исследования с применением сенсоров были выполнены как на клеточных культурах, так и на опухолях животных invivo, что несомненно свидетельствует о высоком потенциале новых сенсоров на основе флуоресцентных белков для изучения онкогенеза.Следует отметить, что 2 устных и 2 стендовых доклада в секции «Флуоресцентные белки» были представлены от коллектива, возглавляемого ведущим ученым С.А. Лукьяновым в Институте биоорганической химии РАН:

1. A.S. Mishin(Russia), N.V. Povarova, K.S. Sarkisyan, M.S. Baranov, and K.A. Lukyanov.RATIONAL SELECTION OF BACTERIAL PROTEINS FOR SPECIFIC BINDING OF FLUOROGENIC CHROMOPHORES.
   
2. N.M. Mishina(Russia),I. Bogeski, S. Lukyanov, and V.V. Belousov. IMAGING PIP3 AND h3O2 WITH ONE GENETICALLY ENCODED FLUORESCENT SENSOR
   
3. K.S. Sarkisyan(Russia), A.S. Goryashchenko, A.P. Savitsky, K.A. Lukyanov, and A.S. Mishin. A BRIGHT MONOMERIC GREEN FLUORESCENT PROTEIN WITH A FLUORESCENCE LIFETIME OF 5.0 ns
   
4. E.V. Putintseva(Russia), D.M. Chudakov, and A.M. Bogdano BRIGHT CIRCULARLY PERMUTED VARIANTS OF FLUORESCENT PROTEIN FUSIONRED
   

Поскольку флуоресцентные белки являются незаменимыми инструментом оптических методов визуализации, ряд докладов об их применении прозвучал в соответствующей тематической конференции «Оптический биоимиджинг». Применение флуоресцентных оптических методов позволяет прижизненно и неинвазивно изучать распределение флуорофора в тканях животных на уровне целого организма. Данная тематика была отражена в докладах зарубежных и российских участников, посвященных разработке новых флуоресцирующих маркеров и созданию экспериментальных моделей флуоресцирующих опухолей, развитию методов флуоресцентногоимиджинга и трехмерной визуализации опухолей в биологическом эксперименте и клинике. В докладе Карстена Кенига (Германия) была представлена новая уникальная система для многофотонной томографии с опцией CARS и показаны ее возможные приложения для экспериментальных работ на мелких лабораторных животных и в клинической практике. В докладе Ильи Фикса (ИПФ РАН) были рассмотрены математические аспекты флуоресцентной томографии опухолей, генетически меченных флуоресцентными белками. Александр Горяченко (ИНБИ РАН) в своем докладе рассказал про новый дальне-красный FREТ-сенсор для определения активности каспазы-3, который был разработан совместно с группой С.А. Лукьянова в ИБХ РАН. Об актуальности создания новых флуоресцентных белков, обладающих высоким поглощением в красной области, неоднократно упоминалось в докладах по оптоакустическому имиджингу — А.В. Субочев (ИПФ РАН), Мартин Френц (Швейцария). Высокую заинтересованность участников вызвал доклад Н.В. Клементьевой (Нижегородская медицинская академия) о биолюминесцентномимиджинге опухолевых клеток с помощью улучшенной люциферазы светляка Luc2. Стоит отметить, что линии клеток, экспрессирующиеLuc2, и эксперименты по их наблюдению invitro и invivo были сделаны в лаборатории «Флуоресцентного биоимиджинга» под руководством С.А. Лукьянова.

На сегодняшний день флуоресцентные белки служат универсальным инструментом для различных задач в биомедицинских исследованиях. Поэтому их применение многократно демонстрировалось также в рамках конференции «Нейробиофотоника».В частности, наблюдение функций клеток во флуоресцентно — меченых нейрональных культурах и новые способы получения и обработки данных о нейронах были показаны в докладах Дайзуке Ито (Япония), И.В. Мухиной ((Нижегородская медицинская академия), А. Семьянова (Япония), Ю.Н. Захарова (ННГУ), Т. Сахарновой (Нижегородская медицинская академия), Е. Агрба (Нижегородская медицинская академия), Я. Мытаевой (Нижегородская медицинская академия) и др.

В рамках семинара «Биофотоника в исследовании стволовых клеток и биологии развития» были затронуты вопросы изучения эмбрионального развития млекопитающих и роли стволовых клеток посредством новейших методов биоимиджинга, в том числе с использованием флуоресцентных белков. Например, в докладе И. Адамейко (Каролинский институт, Стокгольм, Швеция) было представлено описание возможностей использования конфокального имиджинга и оптической проекционной томографии с последующим формированием 3-D – моделей при изучении миграции меченых белками стволовых клеток нервного гребня эмбриона млекопитающих. Большой интерес слушателей вызвала работа И. Лариной (США) «Изучение развития эмбрионов млекопитающих с использованием оптического имиджинга», в которой флуоресцентные белки применялись для прижизненного наблюдения тканей эмбрионов мыши. Доклады Е.И. Черкасовой (ННГУ) и А.В. Мелешиной (ННГУ) были посвящены исследованию взаимодействия мезенхимальных стволовых клеток с опухолью. В данном случае стволовые и/или опухолевые клетки стабильно экспрессировали флуоресцентные белки, что позволяло детектировать их в тканях флуоресцентными методами.

В работе конференции принимали участие российские и зарубежные ученые различных специальностей: физики, химики, биологи, медики. Активное участие в работе конференции приняли молодые ученые – студенты, аспиранты, молодые кандидаты наук. Конференция имела выраженную биомедицинскую направленность и создала предпосылки для развития новых научных проектов на стыке научных дисциплин. Научная программа конференции формировалась с учетом современных тенденций мировой науки в сфере биофотоники, в том числе флуоресцентного биоимиджинга и практического применения флуоресцентных белков в биологии и медицине для изучения механизмов физиологических и патологических процессов в живых системах.

Обзор сделанных на симпозиуме докладов и обсуждавшейся проблематики показал высокий интерес научного сообщества к сравнительно новому направлению, но получившему мощное развитие — флуоресцентному биоимиджингу, особенно с применением генетически кодируемых флуорофоров – флуоресцентных белков. Характерно, что последние разработки в области флуоресцентных белков свидетельствуют о возможности их применения не только в качестве меток для последующего флуоресцентного наблюдения, но и в качестве высокочувствительных сенсоров для изучения функций клеток и в качестве терапевтических для активного воздействия на патологические клетки, что значительно расширяет области их примененияв биомедицине. Участие в симпозиуме большого числа членов творческого коллектива создало предпосылки для плодотворного развития научных исследований по тематике проекта. Прошедшие в рамках симпозиума обсуждения и дискуссии актуальных вопросов флуоресцентного биоимиджинга и активное участие молодых ученых обеспечили приток новых идей, которые станут основой для успешной реализации проекта.

Большое число зарубежных ученых, принявших участие в конференции, говорит об их заинтересованности в налаживании научных контактов с российскими коллегами. А активное участие в симпозиуме молодых исследователей свидетельствует об их высоком интересе к сфере биофотоники и, несомненно, является полезным для дальнейшей научной карьеры.

Формат симпозиума предоставил возможность для плодотворных научных контактов между участниками различных конференций по вопросам, представляющим взаимный интерес. Все это обусловило высокий уровень и успех проведенного научного мероприятия.

Проект № 11.G34.31.0017 от 24 ноября 2010 года – 2010-2012 г.г. ОРГАНИЗАЦИЯ И ПРОВЕДЕНИЕ III МЕЖДУНАРОДНОГО СИМПОЗИУМА
«TOPICAL PROBLEMS OF BIOPHOTONICS -2011» III Международный симпозиум «Актуальные проблемы биофотоники» проходил с 16 по 22 июля 2011 г на борту теплохода «Георгий Жуков», совершавшего круиз по маршруту Санкт-Петербург – Нижний Новгород. Организаторами симпозиума являлияь Институт прикладной физики РАН, Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Нижегородская государственная медицинская академия, компания ГИКОМ, ООО «Квантрон—НН» и Правительство Нижегородской области.

Симпозиум объединил четыре тематические конференции: «Оптический биоимиджинг», «Нанобиофотоника», «Нейроимиджинг и нейродинамика», «Современные лазеры в биомедицине» и Российско-Германский семинар «Клиническая биофотника». Программа симпозиума включала пленарные, устные и стендовые доклады. Рабочим языком симпозиума был английский.

Общая цель симпозиума – представить современное состояние исследований, концепции и перспективы развития методов и подходов биофотоники при изучении биологических объектов и человека.

Всего в симпозиуме принимало участие 227 человек из 22 стран мира

Среди участников конференции было 26 членов творческого коллектива лаборатории «Флюоресцентного биоимиджинга».

7 членов творческого коллектива вошли в состав организационного комитета симпозиум:

Загайнова Е.В председатель конференции «Нанобиофотоника» Шахова Н.М председатель конференции «Оптичекий биоимиджинг» Деев С.М член программного комитета конференции «Нанобиофотоника» Ширманова М.В ученый секретарь конференции «Нанобиофотоника» Турчин И.В ученый секретарь конференции «Оптичекий биоимиджинг» Кириллин М.Ю ученый секретарь Российско-Германского семинара «Клиническая биофотника» Сергеева Е.А. ученый секретарь конференции «Нейроимиджинг и нейродинамика».

23 человека были авторами и соавторами докладов и выступили на симпозиуме с научными докладами:

1. Sergey Deyev, Protein-assisted self-assembly of nanoparticles for bioimaging and drug delivery (Plenary)

1. M.Yu. Kirillin, P.D. Agrba, E.A. Sergeeva, E.A. Bakshaeva, et al., Contrast enhance-ment in optical tomography of biotissues (Invited)

1. M. Shirmanova, S.Lukyanov, E. Zagaynova, et al., Fluorescent protein Killer-Red as a potential photosensitizer for cancer treatment (a pilot study)

1. E.B. Kiseleva, N.D. Gladkova, O.S. Streltsova, N.S. Robakidze, et al., Numerical analysis of CP-OCT images in clinical study

1. M. Sirotkina, V.V. Elagin M.V. Shirmanova, V.A. Nadtochenko, et al., Local hyper-thermia of a cervical carcinoma based on gold nanoparticles

1. I. Fiks, M. Kirillin, E. Sergeeva, and I. Turchin, Reconstruction method for solving inverse problem in diffuse fluorescence tomography based on non-negative Tikhonov regularization

1. A.G. Orlova, A.V. Maslennikova, G.Yu. Golubiatnikov, V.A. Kamensky, et al., Monitoring of experimental tumor oxygenation by diffuse optical spectroscopy

8. P.D. Agrba, E.A. Bakshaeva, and M.Yu. Kirillin, The effect of biotissue deformation on OCT image contrast

1. V.V. Elagin, A.A. Brilkina, E.A. Sergeeva, M.A. Bugrova, et al., The combined influence of gold nanoparticles and laser radiation on cancer cells in vitro

1. E.I. Cherkasova, E.A. Minakova, M.V. Shirmanova, E.V. Kiseleva, et al., Fluorescence imaging of the tumor – mesenchimal stem cells interaction

1. A.A. Brilkina, L.V. Dubasova, I.V. Balalaeva, E.A. Sergeeva, et al., Study of photosensitizers uptake and intracellular distribution in human normal and malignant cell lines

1. N. Gladkova, F. Feldchtein, Yu. Fomina, M. Karabut, et al., Laser patterned microcoagulation (LPM) treatment of gingival pathology: pilot clinical study

1. A.N. Morozov, V.A. Kamensky, M.Y. Kirillin, and M.A. Shakhova, Polarized reflectance spectroscopy based on polarization maintaining single mode optical fiber

1. E.A. Sergeeva, A.R. Katichev, and M.Yu. Kirillin, Refined forward problem solution for biotissue optical properties reconstruction

1. A.R. Katichev and E.A. Sergeeva, GPU-based simulation of nonlinear fluorescence imaging in biotissue with inhomogeneous fluorophore distribution

1. L.B. Snopova, N.N. Prodanets, E.V. Zagaynova, O.S. Strelzova, and A.G. Orlova, Fluorescence cystoscopy, optical coherence tomography and immunohistochemistry for detection of early bladder cancer

1. P.V. Subochev, R.V. Belyaev, A. Morozov, and I.V. Turchin, High-frequency acoustic detectors for photoacoustic tomography

1. V.A. Vodeneev, E.K. Akinchits, L.A. Orlova, and I.V. Balalaeva, Fluorescent analysis of excitation potentials generation in higher plants

1. N.Y. Lekanova, M.V.Shirmanova, I.V. Balalaeva, L.G. Klapshina, and E.V. Zagaynova, Biocompatible polymeric nanoparticles dopped with ytterbium porphyrazine as potential photosensitizer

1. M.S. Kleshnin, I.I. Fiks, I.V. Turchin, I.V. Balalaeva, and A.P. Savitsky, Fluorescence imaging with lifetime and spectral resolution for detection of RFP-expressed tumors

1. M. Karabut, N. Gladkova, F. Feldchtein, Y. Fomina, et al., Oral mucosa regeneration after laser patterned microcoagulation treatment: an animal study

1. А. Maslennikova, N.Gladkova, I. Balalaeva, E. Kiseleva, M.Karabut, R.Iksanov. In vivo imaging of oral mucosa microstracture by OCT for mucositi sprediction

1. I.V. Balalaeva, E.A. Malekhanova, N.Y. Lekanova, I.V. Krutova, et al., Studies of anti-HER2/neu immunotoxin antineoplastic activity on fluorescent tumor model

Полная программа симпозиума представлена в приложении.

Сайт конференции http://www.biophotonics.sci-nnov.ru/

Научная тематика симпозиума имеет прямое отношение к исследованиям, проводимым в рамках проекта. В рамках конференции ««Нанобиофотоника» была организована отдельная секция «Флуоресцентные белки для биомедицинских приложений». На этой секции были представлены доклады, раскрывающие природу флуоресценции белков и их фотобиологичекие свойства (Анна Салих, Университет Западного Сиднея, Австралия; Александр Русанов, Инситут биохимии им. Баха РАН, Россия; Дмитрий Щербо, Институт биоорганической химии РАН, Россия). Особое внимание было уделено использованию флуоресцентных белков для визуализации и лечения опухолей (Роберт Хоффман, Компания Антиканцер, Университет Калифорнии, Сан-Диего, США; Алексей Богданов, Институт биоорганической химии РАН, Россия; Марина Ширманова, Нижегородская медицинская академия, Россия).

2 доклада на данной секции были представлены от коллектива, возглавляемого ведущим ученым С.А. Лукьяновым в Институте биоорганической химии РАН:

1. D. Shcherbo (Russia), I.I. Shemyakina, A.G. Zaraisky, et al., Near-infrared fluorescent proteins for whole-body imaging

2. A. Bogdanov (Russia), A.V. Titelmaer, and K.A. Lukyanov, Oxidative photoconversion of GFPs in vitro and in vivo.

Также в рамках тематической конференции «Оптический биоимиджинг» обсуждались практически все перспективные направления современного биоимиджинга: когерентные оптические методы и оптическая когерентная томография, оптическая диффузионная томография, биомедицинская спектроскопия и микроскопия, многофотонная микроскопия, а также флуоресцентный имиджинг для биомедицинских наук. Флуоресцентному биоимиджингу на симпозиуме был посвящен целый ряд докладов. Данная задача стала особенно актуальна в связи с последними успехами в биологии – разработкой различных флуоресцирующих агентов, таких, как специфические маркеры и флуоресцирующие белки. Применение флуоресцентных оптических методов позволяет изучать распределение флуорофора в тканях животных на уровне целого организма. Данная тематика была отражена в докладах зарубежных и российских участников, посвященных разработке новых флуоресцирующих маркеров и создания экспериментальных моделей флуоресцирующих опухолей, развитию методов флуоресцентного имиджинга и трехмерной визуализации опухолей в биологическом эксперименте и клинике. Работа Джорджа Риполла (Институт электронных структур и лазеров – F.O.R.T.H., Греция) была посвящена новым вариантам облучения и детектирования сигнала в микроскопии для трехмерного in vivo имиджинга. В докладе А.П. Савицкого (Институт Биохимии им. А.Н. Баха, Россия) прозвучали результаты комплексного исследования биораспределения флуоресцентных полупроводниковых нанокристаллов различного состава и покрытия в организме экспериментальных животных, сделан акцент на различия в их токсичности и применимости для in vivo исследований. В программе конференции были представлены работы, посвященные использованию новой флуоресцирующей опухолевой модели для исследования распределения фотосенсибилизирующих агентов в преклиническом эксперименте. Кроме того, были представлены доклады, посвященные разработке новой экспериментальной опухолевой модели для контроля противоопухолевой активности новых таргетных препаратов. Ряд докладов был посвящен развитию метода многофотонной флуоресцентной микроскопии и ее практическому применению для экспериментального изучения биологических систем и адаптации для медицинского применения, а так же результатам фундаментальных исследований биотканей и клинической диагностики с использованием данного метода (К. Кениг – Университет Саарланда, Германия; А. Учугунова – Университет Саарланда, Германия).

В докладах Д. Щербо, А. Богданова, М. В. Ширмановой, А.Г. Орловой, П.В. Субочева, И.И. Фикса, М.С. Клешнина, И.В. Балалаевой были продемонстрированы научные результаты, полученные непосредственно в рамках выполнения проекта.

В работе конференции принимали участие российские и зарубежные ученые различных специальностей: физики, химики, биологи, медики. Активное участие в работе конференции приняли молодые ученые – студенты, аспиранты, молодые кандидаты наук. Конференция имела выраженную биомедицинскую направленность и создала предпосылки для развития новых научных проектов на стыке научных дисциплин. Научная программа конференции формировалась с учетом современных тенденций мировой науки в сфере биофотоники, в том числе флуоресцентного биоимиджинга и практического применения флуоресцентных белков в биологии и медицине для изучения механизмов физиологических и патологических процессов в живых системах.

Обзор сделанных на симпозиуме докладов и обсуждавшейся проблематики показал высокий интерес научного сообщества к сравнительно новому направлению, но получившему мощное развитие — флуоресцентному биоимиджингу, особенно с применением генетически кодируемых флуорофоров – флуоресцентных белков. Участие в симпозиуме большого числа членов творческого коллектива создало предпосылки для плодотворного развития научных исследований по тематике проекта. Прошедшие в рамках симпозиума обсуждения и дискуссии актуальных вопросов флуоресцентного биоимиджинга и активное участие молодых ученых обеспечили приток новых идей, которые станут основой для успешной реализации проекта.

Большое число зарубежных ученых, принявших участие в конференции, говорит об их заинтересованности в налаживании научных контактов с российскими коллегами. А активное участие в симпозиуме молодых исследователей свидетельствует об их высоком интересе к сфере биофотоники и, несомненно, является полезным для дальнейшей научной карьеры.

Формат симпозиума предоставил возможность для плодотворных научных контактов между участниками различных конференций по вопросам, представляющим взаимный интерес. Все это обусловило высокий уровень и успех проведенного научного мероприятия.

Определение флуоресцентного излучения по Merriam-Webster

флуоресцентный | \ flu̇-ˈre-sᵊnt , flȯ- \

2 : яркий и светящийся в результате флуоресценции флуоресцентные чернила широко : очень яркие цвета

Что такое люминесцентное освещение?

Люминесцентное освещение.Вы, наверное, уже имеете представление о том, что это такое. Может быть, вы хоть немного разбираетесь в том, как это работает.

Конечно, люминесцентное освещение опасно для глаз и размывает цвет лица.

Но флуоресцентное освещение — это гораздо больше, чем не очень идеальные побочные эффекты, включая некоторые приятные преимущества.

Вот что мы обсуждаем в этом посте:

Что такое люминесцентное освещение?

Флуоресцентное освещение — это универсальный тип освещения, с которым вы, скорее всего, столкнетесь в офисе, школе или продуктовом магазине.Он известен своей энергоэффективностью по сравнению с лампами накаливания и галогеновыми лампами и более низкой ценой по сравнению со светодиодами.

Существует несколько различных типов люминесцентного освещения, включая линейные люминесцентные лампы, люминесцентные изогнутые лампы, люминесцентные лампы с круговой линией и компактные люминесцентные лампы (компактные люминесцентные лампы).

В этой статье мы сосредоточимся на линейных люминесцентных лампах из-за их популярности. Люминесцентные лампы обычно используются в потолочных светильниках, таких как troffers, во всех типах коммерческих зданий.

Как работают люминесцентные лампы?

Флуоресцентное освещение зависит от химической реакции внутри стеклянной трубки для создания света. Эта химическая реакция включает взаимодействие газов и паров ртути, в результате чего образуется невидимый ультрафиолетовый свет. Этот невидимый ультрафиолетовый свет освещает люминофорный порошок, покрывающий внутреннюю часть стеклянной трубки, излучающий белый «флуоресцентный» свет.

Вот более подробная разбивка процесса:

Электричество сначала попадает в осветительную арматуру, как трос, и через балласт.Балласт, который регулирует напряжение, ток и т. Д. И необходим для работы люминесцентной лампы, подает электричество на контакты люминесцентной лампы на обоих концах.

Подробнее: Что такое балласт и как он работает?

Затем, после того, как электричество проходит через контакты, оно течет к электродам внутри герметичной стеклянной трубки, в которой поддерживается низкое давление. Электроны начинают перемещаться по трубке от одного катода к другому.

Внутри стеклянной трубки находятся инертные газы и ртуть, возбуждаемые электрическим током.Ртуть испаряется, когда течет электричество, и газы начинают реагировать друг с другом, создавая невидимый ультрафиолетовый свет, который мы фактически не видим невооруженным глазом.

Но мы, очевидно, замечаем люминесцентные лампы, излучающие свет, так что же именно мы видим?

Каждая люминесцентная лампа покрыта люминофорным порошком. Если воткнуть палец в тюбик и потереть его изнутри, это будет выглядеть так, как будто вы только что насладились порошкообразным пончиком.

Это люминофорное покрытие светится, когда оно возбуждается невидимым ультрафиолетовым светом, и это то, что мы видим нашими глазами — светящийся порошок люминофора, который создает «белый свет».Отсюда и термин «флуоресцентный» — «светящийся белый свет».

Из-за содержания ртути в люминесцентных лампах важно утилизировать лампы после того, как они перегорели. У нас есть служба утилизации, которая позволяет легко и быстро избавиться от старых перегоревших ламп из вашего шкафа и забыть о них. Мы также продаем коробки для вторсырья.

Зачем люминесцентным лампам балласт?

Основная цель балласта — принимать переменный ток, проходящий через провода в ваших стенах — буквально волнами, вверх и вниз — и превращать его в постоянный и прямой поток электричества.Это стабилизирует и поддерживает химическую реакцию, происходящую внутри колбы.

Чтобы правильно выбрать балласт для ваших ламп, вам необходимо ответить на эти три вопроса:

1. Какому типу лампы требуется питание? (Например, это T8, T5? 4 фута? 2 фута? И т. Д.)
2. Сколько ламп нужно мощности?
3. Какое напряжение идет на прибор?

Балласты влияют на потребление энергии через так называемый балластный фактор.Подробнее о балластном факторе и его влиянии на потребление энергии читайте здесь.

Почему люминесцентные лампы становятся розовыми и оранжевыми?

Если вы посмотрите на большую комнату, освещенную в основном люминесцентными лампами, то с большой вероятностью вы увидите все виды разных цветов, исходящих с потолка. Почему?

Эта концепция называется «смещение цвета». Чем дольше горят флуоресцентные лампы, тем больше вероятность того, что химические свойства изменятся и вызовут несбалансированную реакцию, в результате чего флуоресценция станет менее белой и менее яркой, чем была раньше.

Если последовательность действительно важна для вашего проекта освещения, вы можете подумать о групповой замене этих лампочек. Заменяя все трубки партиями, вы можете устранить проблему несоответствия цветов и яркости в вашем помещении.

Еще одно соображение — это обновление светодиодов для ваших ламп. О вариантах светодиодных ламп T8 мы поговорим в этой статье.

В чем разница между линейными люминесцентными лампами и компактными люминесцентными лампами?

Чтобы уточнить, как в линейных, так и в компактных люминесцентных лампах используется одна и та же технология для создания искусственного света.Самая большая разница — это форм-фактор или размер и конфигурация ламп CFL.

Компактные люминесцентные лампы (КЛЛ) — это просто усовершенствование линейной люминесцентной технологии, потребляющее меньше энергии. Они также предназначены для ввинчивания в обычную розетку для лампы накаливания или для вставки в утопленную банку. Их часто называют «пружинными лампами» или «подключаемыми» КЛЛ в зависимости от назначения и формы.

Узнайте больше о компактных люминесцентных лампах в нашем посте: «Что такое лампы CFL и где их следует использовать?»

Где вы используете линейное люминесцентное освещение?

Хотя люминесцентные лампы используются в самых разных областях, они работают не везде.Самая распространенная причина, по которой люди используют люминесцентные лампы, — это экономия энергии с минимальными первоначальными затратами.

Вот некоторые типичные области применения линейного люминесцентного освещения:

Коммерческие офисы

Обычно офисные помещения не слишком заботятся о декоративном и акцентном освещении. Главный приоритет — общее освещение, функциональное для офисной среды. Из-за этого линейные люминесцентные лампы являются основными лампами, используемыми в офисных помещениях в США.

Склады

Если вы не знакомы с T5 с высокой выходной мощностью, вам необходимо это знать.Эти лампы могут прослужить до 90 000 часов и производить больше света (люмен), чем более толстые линейные люминесцентные лампы, такие как T12s и T8s. Из-за этого они являются отличным выбором для складов — или вообще для любого многоярусного потолка, где требуется значительное количество света.

Больницы

Подобно офисным помещениям, в больницах также используются линейные люминесцентные лампы для экономии энергии и получения белого, чистого и эффективного источника света.

Розничные магазины

При создании уникального дизайна освещения для розничной торговли мы рекомендуем правило 20/80 — 20 процентов вашего освещения должно быть декоративным и уникальным (например, настенные бра, люстры, чаши с облаками).И 80 процентов его должно быть стандартным общим освещением.

В таких универмагах, как Macy’s, JC Penney, Kohl’s и Target, 80-процентное общее освещение является основной областью для линейных флуоресцентных ламп.

Плюсы и минусы линейного люминесцентного освещения

Линейные люминесцентные профи

• Энергоэффективность

  Переоборудовав лампы накаливания или галогенные на линейные люминесцентные лампы, вы можете рассчитывать на 40-процентную экономию на счетах за электроэнергию.

• Разнообразие цветовых температур

  Если вам нужно действительно «прохладное» пространство, такое как коридор больницы или станция метро, ​​флуоресцентные лампы предлагают такую ​​прохладную цветовую температуру, как 6500 Кельвинов. Хотя не так много приложений, в которых требуется настолько холодный свет, диапазон цветов от теплого до холодного — это гибкость для флуоресцентных ламп.

• Стоимость

  По сравнению со светодиодами, линейное люминесцентное освещение, как правило, более доступно.Фактически, светодиоды привели к снижению цен на флуоресцентные лампы за последние несколько лет.

Линейные флуоресцентные прожекторы

• Изменение цвета или уменьшение светового потока

  Как мы упоминали выше, чем дольше горят флуоресцентные лампы, тем больше вероятность того, что химические свойства изменятся, что вызовет несбалансированную реакцию, что сделает флуоресценцию менее белой и менее яркой, чем была раньше. Светоотдача снижается, и со временем ваше освещение может выглядеть как лоскутное одеяло.

• Резкий свет

  Флуоресцентные лампы не приятны для глаз! Если вы обнаружите, что ваши глаза часто налиты кровью или сухие, вы можете оценить источник света, под которым вы находитесь большую часть дня. Например, линейные люминесцентные лампы в параболических троферах в офисном помещении могут вызвать у вас подсознательное косоглазие из-за резкого света. Лучшим применением были бы линейные флуоресцентные лампы в центральном фильтре, который смягчает свет, падающий на землю.

• Период прогрева

  Для того, чтобы флуоресцентные лампы достигли своей полной яркости, вам, возможно, придется подождать 10-30 секунд для прогрева.

• Воздействие на окружающую среду или Затраты на переработку

  Хотя затраты на переработку перевешиваются за счет экономии энергии, создаваемой флуоресцентными лампами, существуют дополнительные расходы на обеспечение правильной утилизации люминесцентных ламп. Если вы не хотите вообще заниматься ртутью и переработкой, светодиоды могут быть для вас лучшим вариантом.

Есть еще вопросы о том, подходит ли флуоресцентное освещение для вашей области применения? Поговорите со специалистом по освещению, который расскажет о специфике вашего помещения.

Люминесцентные лампы | B&H Photo Video

Выбор флуоресцентного света для фотографии

Выбор подходящего люминесцентного освещения для студии означает понимание его преимуществ. Люминесцентные лампы обеспечивают непрерывный свет, который можно приглушить или сделать ярче во время фотосессии. При непрерывном студийном освещении, таком как флуоресцентные или вольфрамовые лампы, освещение, которое вы наблюдаете в студии, отражается на фотографиях.

Из чего сделаны люминесцентные лампы?

Цветные люминесцентные лампы бывают белого, зеленого, теплого желтого или красного оттенков.Люминесцентные лампы — это энергоэффективные искусственные источники света, которые создаются путем смешивания паров аргона и ртути с последующей зарядкой химических веществ металлическими электродами с щелочным покрытием. Электричество соединяется с газом и ионизирует его, а затем люминофор превращает его в свет. Другими формами энергоэффективного искусственного освещения для фотографии являются светодиодные фонари, которые производят освещение, подобное естественным источникам, таким как солнце.

Использование люминесцентных ламп в фотографии

Новые люминесцентные лампы излучают мягкий свет, как лампы накаливания, что делает их отличным вариантом для портретной фотографии.Еще одно распространенное использование флуоресцентных ламп для фотосъемки — это изображения продуктов. При использовании компактных люминесцентных ламп выберите параметры с индексом цветопередачи или CRI 90 или выше для достижения наилучших результатов при смешивании с дневным светом. Другие версии, такие как 8-футовые люминесцентные лампы, которые покрывают большую площадь, хорошо подходят для съемки на открытом воздухе и моделирования. Подставки для розеток люминесцентных ламп могут поставляться в комплектах с вариантами зонтов, отражателей или зеленых экранов для увеличения диапазона фотографии. Выбирайте люминесцентные подставки для розеток, которые имеют от одной до семи розеток, для небольшой или большой зоны покрытия.

B&H Photo and Video предлагает комплекты люминесцентного и непрерывного освещения для профессиональных фотографов и любителей. Подберите подходящие варианты освещения люминесцентными, светодиодными и лампами накаливания для своей студии.

Недостатки люминесцентного освещения — энергоэффективное освещение

Люминесцентные лампы — это особый тип газовых светильников, которые излучают свет в результате химической реакции, в которой газы и пары ртути взаимодействуют с образованием ультрафиолетового света внутри стеклянной трубки.Ультрафиолетовый свет освещает люминофорное покрытие на внутренней стороне стеклянной трубки, которое излучает белый «флуоресцентный» свет. Флуоресцентные лампы имеют множество преимуществ перед старыми осветительными приборами, такими как лампы накаливания. Они намного эффективнее, поэтому потребляют меньше энергии. Они также имеют более продолжительный срок службы — примерно в 13 раз дольше, — поэтому их не нужно менять так часто.

Благодаря широкой доступности люминесцентных ламп, их можно найти практически везде — в школах, больницах, продуктовых магазинах, офисных зданиях, торговых центрах и наших домах.Хотя в ближайшем будущем технология светодиодов (светоизлучающих диодов) должна заменить люминесцентные лампы в качестве «короля выбора зеленого освещения», многие руководители предприятий продолжают использовать люминесцентные лампы в своих зданиях. На данный момент люминесцентные осветительные приборы могут быть дешевле, чем их более эффективные светодиодные аналоги, но у люминесцентного освещения есть недостатки, которые необходимо учитывать.

Компактные люминесцентные лампы (КЛЛ) и люминесцентные лампы

Основное различие между ними — размер и применение.Большинство компактных люминесцентных ламп (КЛЛ) имеют особую форму, которая позволяет их вставлять в стандартные бытовые розетки. Еще одно отличие состоит в том, что для линейных люминесцентных ламп требуется независимый балласт, отдельный от лампы, тогда как в большинстве компактных люминесцентных ламп балласт встроен в цоколь.

И линейные, и компактные люминесцентные лампы излучают искусственный свет по той же технологии. В компактных люминесцентных лампах по-прежнему используются лампы, но, как следует из названия, они намного меньше, чем их аналоги с линейными лампами.Лампы CLF были разработаны для замены стандартных применений для ламп накаливания и представляют собой просто усовершенствования линейной люминесцентной технологии за счет увеличения срока службы и более эффективного освещения.

Использование флуоресцентного освещения

Раньше люминесцентным лампам требовался период «прогрева», чтобы испарить их внутренние газы в плазму. С тех пор было разработано несколько технологий почти мгновенного запуска, включая «быстрый запуск», «мгновенный запуск» и «быстрый запуск».”

Поскольку люминесцентные лампы нагреваются, для их работы требуется большее напряжение. Требуемое напряжение регулируется балластом — магнитным устройством, регулирующим напряжение, ток и т. Д., — который необходим для зажигания люминесцентной лампы. По мере того как люминесцентный свет стареет и со временем становится все менее и менее эффективным, ему требуется все больше и больше напряжения для получения того же количества света, пока напряжение в конечном итоге не превысит возможности балласта и свет не выйдет из строя.

Недостатки люминесцентного освещения

Флуоресцентное освещение существует уже более 100 лет и остается недорогим вариантом для модернизации старых осветительных приборов.Флуоресцентные лампы обычно являются высокоэффективным способом освещения большой площади, они более эффективны и служат дольше, чем лампы накаливания; однако показано, что использование исключительно флуоресцентного освещения оказывает негативное влияние на эргономику и здоровье.

1. Люминесцентные лампы содержат токсичные материалы.

Ртуть и фосфор внутри люминесцентных ламп опасны . Если люминесцентная лампа разбита, небольшое количество токсичной ртути может выделяться в виде газа, загрязняя окружающую среду.Остальное содержится в люминофоре на самом стекле, который часто считается более опасным, чем пролитая ртуть.

При чистке разрыва люминесцентной лампы EPA рекомендует проветривать место разрыва и использовать влажные бумажные полотенца для сбора битого стекла и других мелких частиц. Утилизированное стекло и использованные полотенца следует поместить в герметичный пластиковый пакет. Избегайте использования пылесосов, так как они могут привести к попаданию частиц в воздух.

2. Частое переключение приводит к преждевременному выходу из строя.

Люминесцентные лампы значительно стареют, если они установлены в месте, где они часто включаются и выключаются. В экстремальных условиях срок службы люминесцентной лампы может быть намного короче, чем у дешевой лампы накаливания. Как бы то ни было, срок службы люминесцентной лампы можно продлить, если оставить ее включенной в течение длительного времени.

Если вы используете флуоресцентные лампы в сочетании с элементами управления освещением, такими как датчики движения, которые часто срабатывают и по истечении времени ожидания, следует учитывать аспект ранней частоты отказов.

3. Свет от люминесцентных ламп является всенаправленным.

Свет, исходящий от люминесцентных ламп, является всенаправленным. Когда люминесцентная лампа горит, она рассеивает свет во всех направлениях или на 360 градусов вокруг лампы. Это крайне неэффективно, потому что используется только около 60-70% света, излучаемого лампой, а остальная часть тратится впустую. Некоторые области, как правило, становятся чрезмерно освещенными из-за растраченного света, особенно в офисных зданиях, и могут потребоваться дополнительные аксессуары в самом осветительном приборе, чтобы правильно направить выход лампы.

4. Люминесцентные лампы излучают ультрафиолетовый свет.

В исследовании 1993 года исследователи обнаружили, что воздействие ультрафиолета при сидении под флуоресцентными лампами в течение восьми часов эквивалентно одной минуте пребывания на солнце. Проблемы со здоровьем, связанные с светочувствительностью, могут усугубляться искусственным освещением у чувствительных людей. Исследователи предположили, что УФ-излучение, излучаемое этим типом освещения, привело к увеличению числа заболеваний глаз, в первую очередь катаракты. Другие медицинские работники предположили, что повреждение сетчатки, миопия или астигматизм также могут быть объяснены побочными эффектами флуоресцентного света.

Ультрафиолетовый свет также может повлиять на ценные произведения искусства, такие как акварель и текстиль. Произведения искусства должны быть защищены дополнительными стеклянными или прозрачными акриловыми листами, помещенными между источником света и картиной.

5. Старые флуоресцентные лампы терпят непродолжительный период прогрева.

Обычно приходится ждать где-то 10-30 секунд, чтобы старые флуоресцентные лампы достигли полной яркости. Многие новые модели теперь используют «быстрый» запуск или аналогичные технологии, подобные упомянутым выше.

6. Балласт или жужжание.

Магнитные балласты необходимы для работы люминесцентных ламп. Электромагнитные балласты с незначительным дефектом могут издавать слышимый гудящий или жужжащий шум. Однако шум можно устранить, используя лампы с высокочастотными электронными балластами.

7. Воздействие на окружающую среду и стоимость переработки.

Как упоминалось ранее, утилизация люминофора и, что более важно, токсичной ртути в люминесцентных лампах является экологической проблемой.Постановления, введенные правительством, требуют специальной утилизации люминесцентных ламп отдельно от обычных и бытовых отходов.

В большинстве случаев экономия энергии перевешивает затраты на переработку, но переработка остается дополнительными расходами для обеспечения правильной утилизации ламп. В некоторых случаях, если утилизация ламп обходится слишком дорого, людям больше не рекомендуется утилизировать их.

8. Чувствительность люминесцентного света

В течение последних нескольких десятилетий исследование за исследованием показывали случайную связь между воздействием флуоресцентного света и различными негативными эффектами.Все эти проблемы связаны с качеством излучаемого света и основным состоянием людей. Из более чем 35 миллионов человек, страдающих мигренью, большинство из них, вероятно, перенесут общую светочувствительность. Девять из каждых десяти аутичных людей имеют чувствительность к окружающей среде, которая, как сообщается, часто ухудшается при флуоресцентном освещении. Доказано, что при некоторых типах эпилепсии искусственное освещение вызывает приступы.

Подобно другим симптомам светобоязни (или светочувствительности), флуоресцентное освещение может вызывать головные боли / приступы мигрени, напряжение глаз и воспаление, трудности с чтением или фокусировкой, тошноту, чувство тревоги и депрессии, нарушение режима сна и многое другое.Свойства, связанные с флуоресцентным освещением, которые, как считается, влияют на уровень толерантности человека, включают: большое количество синего света, низкочастотное мерцание и общую яркость.

9. Сезонное аффективное расстройство

Сезонное аффективное расстройство, также известное как «Зимняя блюз», часто возникает у людей в зимние месяцы. Это связано с отсутствием полного спектра света, который мы обычно получаем от солнечного света. В унылое серое небо в зимние месяцы большая часть светового спектра блокируется, и наши тела реагируют негативно.

Многие люди сообщают о подобных симптомах, когда они работают при флуоресцентном освещении и не выходят на улицу в течение дня. Без полного спектра света, который мы получаем от дневного света, некоторые функции организма не запускаются и не поддерживаются, что заставляет нас чувствовать себя подавленными на свалках.

Larson Electronics — Взрывозащищенные люминесцентные лампы

Действительно ли красные линзы помогают при охоте на варминтов? (04.01.2017) Практика использования красных линз при охоте на варминтов противоречива.Некоторые охотники — убежденные поклонники этой техники, в то время как другие заявляют, что этот метод неэффективен и является пустой тратой времени. Эта статья призвана развенчать традиционную практику использования красных линз, пролив столь необходимый свет на доводы, лежащие в основе применения цветов во время ночных охотничьих экскурсий.

Сколько света достаточно света (16.08.2016) Варианты освещения различаются в зависимости от потребностей конкретного места и личных предпочтений людей в этом районе.Решение «один размер подходит всем» редко бывает доступно при определении требований к освещению в нескольких средах. Например, конфигурация освещения в офисе может отличаться по сравнению со складом упаковки. Даже если два объекта были одинакового размера, тип работ, выполняемых в зданиях, определяет их свойства или характеристики.

Люмен против фут-свечей — что более точно для измерения освещенности? (16.02.2016) Когда покупатель ищет светильники, чаще всего задают вопрос: «Насколько ярок этот свет?» По мере совершенствования технологии освещения стандартные измерения освещенности не всегда являются наиболее точными при расчете светоотдачи.Понимание того, как определяется каждый рейтинг, поможет вам выбрать лучшее приспособление для приложения.

Преимущества и применение взрывозащищенного светодиодного освещения в замкнутых пространствах (10.02.2016) Сложный и опасный характер замкнутых пространств представляет собой многочисленные риски для рабочих. По этой причине многие предприятия, работающие во взрывоопасных зонах, используют взрывозащищенные фонари для предотвращения возгорания горючих газов и частиц пыли. Светодиодные технологии улучшили характеристики взрывозащищенных светильников, сделав их более надежными, прочными и экономичными.

Будущее освещения: больше не нужно ремонтировать лампы? (28.01.2014) Хотя, с одной стороны, мы наблюдаем сдвиг в сторону использования интегрированных светодиодных ламп / приспособлений, все же существует потенциал для «модульного» подхода к производству светодиодов. Это звучит противоречиво, но давайте поясним немного подробнее. В то время как интегрированная конструкция светодиода / светильника действительно является вероятным путем будущего дизайна освещения, фактическая совокупность светильника на основе светодиодов основана на комбинации нескольких отдельных частей или «модулей».Сами светодиоды представлены только «фишкой»; т

Светодиоды против флуоресцентных: люмен на ватт — это только часть истории (15.11.2013) Сегодня обычным явлением является то, что светильники T8 производят от 80 до 100 люмен на ватт выходной мощности, что ставит люминесцентное освещение на вершину рейтинга эффективного освещения с точки зрения эффективности люмен на ватт. Однако это еще не все, и в игру вступают другие факторы, которые влияют на реальную эффективность флуоресцентного освещения и делают ее немного более приземленной.

Взрывозащищенная защита от горючей пыли (05.12.2012) Однако одной из наиболее серьезных опасностей, которые представляет пыль, является угроза возгорания или взрыва при воздействии источника возгорания. Почти любой тип материала, от железа до пшеницы, может стать взрывоопасным при измельчении в мелкие частицы, и во многих случаях для этого воспламенения достаточно всего лишь искры.

Испытания и сертификация устройств для работы в опасных зонах в США (07.11.2012) В отличие от электрических устройств, предназначенных для использования в типичных коммерческих или домашних условиях, оборудование, используемое в опасных местах, должно предотвращать, запрещать или иным образом снижать опасность, создаваемую горючими газами, парами и материалами, которые могут создавать взрывоопасную атмосферу.Для того, чтобы существовал четкий способ обеспечения минимального уровня защиты, обеспечиваемой устройством, федеральным, государственным и местным агентствам было необходимо принять нормативные акты.

Поэтапный отказ от люминесцентного света T12 и альтернативы модернизации (01.09.2012) Закон об энергетической независимости и безопасности 2007 года помог открыть новую эру более жестких стандартов энергоэффективности, и хотя T12 для своего времени действительно был эффективным светильником, его конструкция такова, что дальнейшие улучшения для повышения его эффективности не являются ни практичными, ни рентабельными. .В результате T12 не может соответствовать новым энергетическим стандартам, необходимым для современных технологий освещения, и с июля 2012 года производство было прекращено.

Основы выбора эффективного освещения окрасочной кабины (18.08.2012) В качестве освещения для большинства покрасочных кабин используются стандартные четырехфутовые люминесцентные лампы, обычно расположенные в светильниках, содержащих две или четыре лампы, сгруппированные вместе. Флуоресцентные лампы популярны, потому что они производят очень широкий спектр светового потока, который помогает равномерно и равномерно освещать неровные поверхности транспортных средств и, таким образом, лучше выявлять недостатки на поверхности, на которую нужно наносить покрытие.Люминесцентные лампы также популярны, потому что они могут работать с различными цветовыми температурами, w

Основы выбора эффективного освещения окрасочной кабины (18.08.2012) В качестве освещения для большинства покрасочных кабин используются стандартные четырехфутовые люминесцентные лампы, обычно расположенные в светильниках, содержащих две или четыре лампы, сгруппированные вместе. Флуоресцентные лампы популярны, потому что они производят очень широкий спектр светового потока, который помогает равномерно и равномерно освещать неровные поверхности транспортных средств и, таким образом, лучше выявлять недостатки на поверхности, на которую нужно наносить покрытие.Люминесцентные лампы также популярны, потому что они могут работать с различными цветовыми температурами, w

Что такое соответствие требованиям взрывозащиты и зачем нам одобренное оборудование? (6.07.2012) Без понимания того, почему требуется оборудование, одобренное для использования во взрывоопасных зонах, практически невозможно должным образом защитить от опасностей, присутствующих в опасных зонах. Оборудование, предназначенное для использования во взрывоопасных зонах, предназначено для защиты от возможности воспламенения воспламеняющихся или взрывоопасных паров, газов, жидкостей, пыли и других опасных воспламеняющихся сред и материалов с помощью такого оборудования.

Горючая пыль: предотвращение пожаров и взрывов требует комплексного подхода (26.06.2012) Опасности горючей пыли варьируются от небольших пожаров, которые могут нарушить работу и потенциально травмировать рабочих, до крупных взрывов и пожаров, когда повреждаются или разрушаются целые объекты и окружающее имущество, а также гибнут люди. С 1980 года в США произошло не менее 350 взрывов горючей пыли, и в некоторых сообщениях СМИ это число выше, в среднем 10 раз в неделю.

Флуоресцентные лампы, светодиоды и индекс цветопередачи: больше, чем просто воспроизведение цвета (31.01.2012) Индекс цветопередачи — это шкала, разработанная некоторое время назад для измерения того, как цвета могут измениться по внешнему виду при освещении источником света по сравнению с принятым стандартным источником света с той же цветовой температурой. Например, цветовую таблицу с несколькими разными цветами можно настроить и осветить лампой накаливания, которая используется в качестве стандартного эталона.Затем та же самая цветовая диаграмма будет освещена люминесцентной лампой, и любые изменения в том, как выглядит каждый из цветов, будут t

Цветовая температура освещения в основных терминах и приложениях (30.01.2012) В коммерческих приложениях чаще всего используются лампы, излучающие холодный белый свет в диапазоне от 4000 до 6500 Кельвинов, потому что их свет более резкий и интенсивный, с лучшей цветопередачей и контрастными свойствами. Объекты, освещаемые этими лампами, кажутся ярче и четче, поэтому эти лампы хорошо подходят для офисов, розничных магазинов и коммерческих помещений, где важны детализация и резкость.Лампы с температурой около 5000-5500 Кельвинов обычно считаются производящими естественную энергию.

Освещение шахт и повышение эффективности и безопасности с помощью светодиодов (20.12.2011) Электрическое освещение для шахт в основном было нескольких конкретных типов, включая лампы накаливания, светильники HID и люминесцентные лампы. Проблемы с такими технологиями освещения шахт в значительной степени связаны с их потребляемой мощностью и низким коэффициентом долговечности. Каждый из этих типов освещения имеет конструкцию, в которой используются хрупкие материалы, такие как стекло и тонкие проволочные нити, которые мало устойчивы к неправильному обращению и условиям.Проблема долговечности усугубляется опасностью

Освещение окрасочной камеры: безопасность и эффективность (22.11.2011) Освещение для окрасочных камер должно соответствовать федеральным и местным нормам, касающимся использования освещения в опасных зонах. OSHA предлагает обширную информацию о взрывозащищенном освещении и опасных местах, и неплохо было бы ознакомиться с тем, что они могут предложить, если вы будете работать в покрасочной кабине. Освещение для окрасочных камер должно быть одобрено для использования во взрывоопасных зонах и иметь сертификат, подтверждающий его пригодность для использования в конкретной среде.Покрасить

Основы освещения покрасочной камеры (26.09.2011) Огромное значение для окрасочных камер имеет соблюдение правил техники безопасности для осветительного оборудования и его пригодность для использования во взрывоопасной среде. Из-за легковоспламеняемости химикатов и соединений, используемых в кабине, удаление потенциальных источников возгорания имеет решающее значение. Поскольку любое используемое электрическое оборудование является потенциальным источником тепла, искр или пламени, оно должно быть правильно спроектировано и сертифицировано для использования в опасных зонах.Освещение кабины Spry Paint, которое МО

Как узнать, действительно ли светильник взрывозащищен? (16.12.2010) Осветительное оборудование для опасных зон в простейшем объяснении используется в местах, где концентрация летучих газов, легковоспламеняющейся пыли или твердых частиц или легковоспламеняющихся химикатов достаточно высока, чтобы представлять опасность возгорания, которое может привести к взрыву или пожару.

Светильники для окрасочной камеры: какой тип лучше всего? (02.09.2010) В большинстве окрасочных камер используется один из двух типов осветительных приборов: люминесцентные лампы или газоразрядные лампы высокой интенсивности.Лампы накаливания — плохой выбор для окрасочных камер, поскольку они очень неэффективны, имеют очень короткий срок службы и выделяют большое количество тепла во время своей работы.

Освещение замкнутого пространства для опасных зон (02.08.2010) Замкнутые пространства представляют собой одни из самых опасных рабочих мест в коммерческих отраслях. Из-за своей замкнутости замкнутые пространства плохо вентилируются и позволяют летучим газам, дымам, парам и твердым частицам накапливаться и увеличиваться в плотности атмосферы до потенциально взрывоопасных уровней.Замкнутое пространство представляет собой опасную рабочую зону и определяется несколькими общими характеристиками.

LED против флуоресцентных и CFL

Вам интересно, что лучше: люминесцентные лампы (включая компактные люминесцентные лампы или КЛЛ) или светоизлучающие диоды (светодиоды)? Что ж, вот прямое сравнение этих двух с последующим подробным обсуждением каждой технологии по очереди.

Флуоресцентный (или CFL):

Что такое люминесцентный свет или КЛЛ?

Люминесцентные лампы представляют собой особый тип газоразрядного света (также известный как разряд высокой интенсивности, HID или дуговая лампа).CFL — это аббревиатура, обозначающая компактную люминесцентную лампу . Стандартные люминесцентные лампы доступны в трубках (обычно от 48 до 84 дюймов в длину). КЛЛ намного меньше. Это все еще трубки, но они, как следует из названия, «компактные». КЛЛ были разработаны, чтобы заменить стандартные лампы накаливания, поскольку они более эффективны и долговечны.

Люминесцентные лампы излучают свет путем преобразования ультрафиолетового излучения с помощью флуоресцентного покрытия на внутренней стороне лампы.УФ-излучение создается в первую очередь электрическим зарядом, который проходит через инертное ртутное стекло внутри колбы. Газ возбуждается электричеством и, как следствие, испускает ультрафиолетовое излучение. Люминесцентные лампы требуют зажигания, которое обычно обеспечивается импульсом напряжения или третьим электродом (дополнительной металлической частью) внутри лампы. Запуск относительно прост с небольшими лампами, но может потребоваться значительное напряжение с большими лампами.

Люминесцентным лампам раньше требовался период «разогрева», чтобы испарить внутренний газ в плазму, но теперь есть несколько технологий почти мгновенного пуска для люминесцентных ламп (к ним относятся «быстрый запуск», «мгновенный запуск», и «быстрый старт»).Кроме того, по мере того, как свет нагревается, для работы требуется дополнительное напряжение. Требования к напряжению в люминесцентных лампах уравновешиваются балластом (магнитное устройство в старых лампах и электрическое в новых люминесцентных технологиях). По мере старения люминесцентного света требуется все больше и больше напряжения для получения того же количества света, пока в конечном итоге напряжение не превысит фиксированное сопротивление, обеспечиваемое балластом, и свет не погаснет (не сработает). Флуоресцентные лампы со временем становятся все менее и менее эффективными, потому что они должны использовать все большее и большее напряжение для обеспечения того же светового потока, что и свет.

В чем преимущество люминесцентных ламп?

Флуоресцентная технология существует уже более 100 лет и обычно представляет собой высокоэффективный способ освещения обширной территории. Светильники намного эффективнее и долговечнее, чем лампы накаливания, однако они терпят неудачу в обеих категориях по сравнению со светодиодами.

Каковы основные недостатки люминесцентных ламп?

Среди недостатков люминесцентного освещения можно выделить следующие:

1. Флуоресцентные лампы содержат токсичную ртуть. Ртуть, а также люминофор внутри ламп являются опасными материалами, которые создают проблему утилизации отходов в конце срока службы лампы. Разбитые лампы выделяют небольшое количество токсичной ртути в виде газа, а остальная часть содержится в самом стекле.
2. Люминесцентные лампы значительно стареют, если их часто включать и выключать. Типичный срок службы лампы для КЛЛ составляет около 10 000 часов, но он может снизиться из-за частого включения (включения и выключения). Срок службы увеличивается, если лампы остаются включенными в течение длительного времени.Об этом стоит подумать в том случае, если вы используете КЛЛ в сочетании с датчиками движения, которые часто срабатывают и выходят из строя.
3. Люминесцентные лампы всенаправленные. Всенаправленные фонари излучают свет на 360 градусов. Это большая неэффективность системы, потому что по крайней мере половина света должна отражаться и перенаправляться в желаемую освещаемую область. Это также означает, что в самом осветительном приборе требуется больше дополнительных деталей, чтобы отражать или фокусировать световой поток лампы (что увеличивает стоимость единицы).

Каковы незначительные недостатки люминесцентных ламп?

Среди незначительных недостатков люминесцентного освещения можно выделить следующие:

1. Старые люминесцентные лампы имеют короткий период прогрева . Как только дуга зажигается, она плавится и испаряет соли металлов внутри устройства. Свет не достигает полной мощности, пока соли полностью не испарятся в плазму. Это исправлено во многих новых моделях, использующих «быстрый запуск» или аналогичные технологии.
2. Флуоресцентное освещение излучает небольшое количество УФ-излучения. Известно, что ультрафиолетовый свет вызывает выцветание окрашенных предметов или картин, подвергшихся воздействию их света.
3. Люминесцентные лампы требуют пускорегулирующего устройства для стабилизации света. В случае незначительной неисправности балласта свет может издавать слышимый гул или гудение.

Где обычно используются люминесцентные лампы?

Обычно флуоресцентное освещение применяется в складских помещениях, школах или коммерческих зданиях.КЛЛ также используются в качестве замены ламп накаливания во многих жилых помещениях.

Светодиодное освещение:

Что такое светоизлучающий диод (светодиод)?

LED — светодиод. Диод — это электрическое устройство или компонент с двумя электродами (анодом и катодом), через которые протекает электричество — обычно только в одном направлении (внутрь через анод и через катод). Диоды обычно изготавливаются из полупроводниковых материалов, таких как кремний или селен — твердые вещества, которые в одних случаях проводят электричество, а в других нет (например.грамм. при определенных напряжениях, уровнях тока или интенсивности света).

Когда ток проходит через полупроводниковый материал, устройство излучает видимый свет. Это полная противоположность фотоэлементу (устройству, преобразующему видимый свет в электрический ток).

Если вас интересуют технические подробности работы светодиода, вы можете прочитать об этом здесь.

• Преимущества светодиодного освещения по сравнению с люминесцентными лампами

Что главное у светодиодных фонарей?

У светодиодного освещения есть четыре основных преимущества:

1. Светодиоды имеют чрезвычайно долгий срок службы по сравнению со всеми остальными осветительными приборами (включая люминесцентные лампы).Срок службы новых светодиодов составляет от 50 000 до 100 000 часов и более. Для сравнения, типичный срок службы люминесцентной лампы составляет в лучшем случае 10-25% (примерно 10 000 часов).
Светодиоды
2. на чрезвычайно энергоэффективны по сравнению с любой другой коммерчески доступной осветительной техникой. Для этого есть несколько причин, в том числе тот факт, что они тратят очень мало энергии в виде инфракрасного излучения (сильно отличается от большинства обычных источников света, включая люминесцентные лампы), и они излучают свет направленно (более 180 градусов по сравнению с 360 градусами, что означает гораздо меньше потерь из-за необходимости перенаправлять или отражать свет).
3. Очень высокое качество света
4. Очень низкие эксплуатационные расходы и хлопоты

Какие незначительные преимущества у светодиодных фонарей?

Помимо основных преимуществ, светодиодные фонари предлагают еще несколько дополнительных преимуществ . К ним относятся следующие:

1. Аксессуары: Светодиоды требуют гораздо меньшего количества дополнительных деталей лампы.
2. Цвет: Светодиоды могут быть разработаны для генерации всего спектра цветов видимого света без использования традиционных цветных фильтров, необходимых для традиционных световых решений.
3. Направленность: светодиода имеют естественную направленность (по умолчанию они излучают свет на 180 градусов).
4. Размер: Светодиоды могут быть намного меньше других источников света.
5. Прогрев: светодиода имеют более быстрое переключение (без периода прогрева или охлаждения).

В чем обратная сторона светодиодного освещения?

Принимая во внимание положительные стороны, можно подумать, что светодиодные фонари — это не проблема. Несмотря на то, что это становится все более актуальным, при выборе светодиода необходимо сделать несколько компромиссов.

В частности, светодиодные фонари относительно дороги. Первоначальные затраты на проект светодиодного освещения обычно выше, чем у большинства альтернатив. Это, безусловно, самый большой недостаток, который необходимо учитывать. Тем не менее, цена на светодиоды быстро снижается, и, поскольку они продолжают массово применяться, цена будет продолжать падать. (Если вы получили предложение о светодиодных лампах, которые стоят слишком дорого, не теряйте надежды. Оптимизация затрат может помочь.)

Где обычно используются светодиоды?

Первое практическое использование светодиодов было в печатных платах для компьютеров.С тех пор они постепенно расширили свои области применения, включив светофоры, световые указатели, а в последнее время — внутреннее и внешнее освещение. Как и люминесцентные лампы, современные светодиодные лампы — прекрасное решение для спортзалов, складов, школ и коммерческих зданий.

Они также могут быть адаптированы для больших общественных мест (требующих мощного и эффективного освещения на большой площади), дорожного освещения (которое дает значительные преимущества в цвете по сравнению с натриевыми лампами высокого и низкого давления) и парковок.Чтобы узнать больше об истории уличного освещения в Соединенных Штатах, читайте здесь.

Дальнейшее качественное сравнение

В чем разница между люминесцентными и светодиодными лампами?

Две разные технологии — это совершенно разные методы получения света. Люминесцентные лампы содержат инертный газ в стеклянном корпусе, а светодиоды — это твердотельная технология. Флуоресцентные лампы производят УФ-излучение, а затем преобразуют его в видимый свет за счет использования люминофорного покрытия внутри лампы.Светодиоды излучают электромагнитное излучение в небольшой части спектра видимого света и не тратят энергию на выброс тепла или невидимого электромагнитного излучения (например, УФ). Есть такая вещь, как IRED (инфракрасный излучающий диод), который специально разработан для излучения инфракрасной энергии.

Почему светодиоды вытеснят люминесцентные лампы из бизнеса?

За последние несколько лет эффективность светодиодов превзошла эффективность люминесцентных ламп, и ее повышение эффективности продвигается гораздо более быстрыми темпами.Кроме того, люминесцентные лампы требуют использования балласта для стабилизации внутреннего тока, излучающего свет. Когда балласт имеет незначительные дефекты или поврежден, свет может издавать слышимый жужжащий шум. К другим недостаткам можно отнести следующие:

• Люминесцентные лампы могут вызвать проблемы при модернизации из-за своей удлиненной формы.
• Люминесцентные лампы могут создавать проблемы с утилизацией отходов из-за их зависимости от ртути.
• Флуоресцентные лампы ненаправленные, то есть они излучают свет на 360 градусов.Как и следовало ожидать, большая часть этого света тратится зря (например, та часть, которая направлена ​​на потолок).

Почему светодиоды вытеснят компактные люминесцентные лампы (КЛЛ) из бизнеса?

Эффективность люминесцентного света не изменилась, а светодиоды лучше (и продолжают улучшаться более быстрыми темпами). Пока работают люминесцентные лампы, светодиодные лампы служат намного дольше. Кроме того, люминесцентные лампы требуют использования балласта для стабилизации внутреннего тока, излучающего свет.Когда балласт имеет незначительные дефекты или поврежден, свет может издавать слышимый жужжащий шум. К другим недостаткам относятся проблемы с удалением отходов (из-за того, что КЛЛ используют ртуть) и генерацию ненаправленного света. Генерация ненаправленного света намного важнее, чем вы думаете. Например, свет, который направлен на потолок, а не в комнату, является потерянным светом. Следовательно, КЛЛ (а также соответствующие стандартные люминесцентные лампы) могут иметь хорошую «эффективность источника» (т.е.е. это хорошо выглядит на бумаге), но будет уступать светодиоду, когда дело доходит до более важного показателя: «эффективность системы» (фактическая эффективность в реальных приложениях).

Прочтите все наши статьи о сравнении освещения!

Люминесцентные лампы | Keystone Technologies

---

Это юридическое соглашение («соглашение») между вами (или организацией, от имени которой вы лицензируете изображения («вы» или «ваш») и Keystone Technologies.Загружая изображения («изображения») с keystonetech.com или любой другой из наших платформ, обслуживающих наши изображения («Сервис»), вы соглашаетесь соблюдать настоящее соглашение, а также нашу Политику конфиденциальности и Условия обслуживания. Если вы не согласны, не загружайте и не используйте эти изображения.

Нам может потребоваться время от времени изменять это соглашение, и вы соглашаетесь соблюдать обязательства в отношении будущих версий.

Не разглашайте свой пароль. Они предназначены только для вашего использования.

1.Право собственности: Все изображения защищены законом об авторских правах США и международными соглашениями об авторских правах. Мы оставляем за собой все права, не предоставленные в этом соглашении.

2. Лицензия: В соответствии с условиями этого соглашения Keystone Technologies предоставляет вам неисключительное, непередаваемое, всемирное бессрочное право на использование и воспроизведение этих изображений в любых коммерческих, художественных или редакционных целях, не запрещенных в это соглашение.

3. Ограничения:
НЕЛЬЗЯ:
1.Распространять или использовать любое изображение способом, который конкурирует с Keystone Technologies. В частности, вы не можете сублицензировать, перепродавать, назначать, передавать, передавать, делиться или предоставлять доступ к изображениям или каким-либо правам на изображения, кроме тех, которые разрешены в этом соглашении.
2. Используйте изображение для представления любых продуктов или услуг, не принадлежащих Keystone Technologies.
3. Добавьте изображение в любой логотип, товарный знак, фирменный стиль или знак обслуживания.
4. Использовать изображение любым незаконным способом или любым способом, который разумный человек может счесть оскорбительным или который может навредить репутации любого лица или собственности, отраженного на изображении.
5. Ложно представить, что вы являетесь первоначальным создателем изображения.
6. Используйте изображение в любом сервисе, претендующем на получение прав на изображение.
7. Нарушать права на товарный знак или интеллектуальную собственность какой-либо стороны или использовать изображение для вводящей в заблуждение рекламы.
8. Удалите или измените любую информацию об управлении авторскими правами Keystone Technologies (например, логотип Keystone) из любого места, где она есть или встроена в изображение.

4. Возможность передачи; Производные работы: Конечным пользователем работы, которую вы производите с изображением, должен быть вы сами или ваш работодатель, клиент или заказчик.Только вам разрешено использовать автономные изображения (вы не можете продавать, сдавать в аренду, одалживать и т. Д. Третьим лицам). Вы можете передавать файлы, содержащие изображения, клиентам, поставщикам или интернет-провайдерам для целей, предусмотренных настоящим соглашением. Вы соглашаетесь принять разумные меры для защиты изображений от извлечения или кражи. Вы незамедлительно уведомите нас о любом неправильном использовании изображений. Если вы передаете изображения, как указано выше, принимающие стороны должны согласиться защищать изображения в соответствии с требованиями настоящего соглашения. Даже при использовании в производной работе наши изображения по-прежнему принадлежат Keystone Technologies.

5. Обзор и записи: С разумным уведомлением вы предоставите Keystone Technologies образцы использования изображений. Вы должны вести учет всего использования изображений, включая подробную информацию об использовании клиентом. Keystone Technologies может периодически запрашивать и проверять такие записи. Если будет обнаружено, что изображения использовались вне рамок данного соглашения, вы удалите изображения по желанию Keystone Technologies.

6. Заявления и гарантии: Мы заявляем и гарантируем, что изображения, предоставленные для загрузки, неизмененные и используемые в полном соответствии с настоящим соглашением, не будут нарушать авторские права, права на товарные знаки или другие права интеллектуальной собственности, а также права третьих лиц на конфиденциальность. или гласность.

ИЗОБРАЖЕНИЯ

ПРЕДОСТАВЛЯЮТСЯ «КАК ЕСТЬ», БЕЗ КАКИХ-ЛИБО ГАРАНТИЙ, ЯВНЫХ ИЛИ ПОДРАЗУМЕВАЕМЫХ, ВКЛЮЧАЯ, НО НЕ ОГРАНИЧИВАЯСЯ, ПОДРАЗУМЕВАЕМЫМИ ГАРАНТИЯМИ ОТСУТСТВИЯ ПРАВ, КОММЕРЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ ИЛИ ПРИГОДНОСТИ ДЛЯ КОНКРЕТНОЙ ЦЕЛИ.

7. Ваше возмещение убытков: Вы соглашаетесь возмещать, защищать и удерживать Keystone Technologies, ее аффилированных лиц, участников, аффилированных лиц, лицензиаров и их соответствующих директоров, должностных лиц, сотрудников, акционеров, партнеров и агентов (совместно именуемые «Keystone Technologies» Стороны ») безвредны по любым претензиям, ответственности, убыткам, убыткам, затратам и расходам (включая разумные судебные издержки на адвокатской и клиентской основе), понесенных любой Стороной Keystone Technologies в результате или в связи с (i) любое нарушение или предполагаемое нарушение вами или кем-либо, действующим от вашего имени, любого из условий этого соглашения, включая, помимо прочего, любое использование нашего веб-сайта или любого изображения, кроме случаев, прямо разрешенных в этом соглашении; (ii) любое сочетание изображения с любым другим контентом или текстом, а также любые модификации или производные работы на основе изображения.

8. Ограничение ответственности: Keystone Technologies не несет ответственности по настоящему соглашению в той мере, в какой это связано с модификацией изображений, использованием в любой производной работе, контекстом, в котором используется изображение, или вашим (или третьим сторона действует от вашего имени), нарушение данного соглашения, халатность или умышленное нарушение.

В САМОЙ ПОЛНОЙ СТЕПЕНИ, РАЗРЕШЕННОЙ ЗАКОНОДАТЕЛЬСТВОМ, НИ KEYSTONE TECHNOLOGIES, НИ КАКИЕ-ЛИБО ИЗ ЕЕ СОТРУДНИКОВ ИЛИ ПОСТАВЩИКОВ НЕ НЕСЕТ ОТВЕТСТВЕННОСТИ ЗА ЛЮБЫЕ ОБЩИЕ, КАЧЕСТВЕННЫЕ, СПЕЦИАЛЬНЫЕ, ИЛИ КОСВЕННЫЕ ИЛИ КОСВЕННЫЕ УСЛУГИ ЛЮБЫЕ ДРУГИЕ УБЫТКИ, ЗАТРАТЫ ИЛИ УБЫТКИ, ВЫЗВАННЫЕ ВАМИ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИЗОБРАЖЕНИЙ, ВЕБ-САЙТА, ​​НАРУШЕНИЯ ДАННОГО СОГЛАШЕНИЯ КОМПАНИИ KEYSTONE TECHNOLOGIES ИЛИ ИНАЧЕ, ЕСЛИ ЯВНО НЕ ПРЕДУСМОТРЕНО, ДАЖЕ ЕСЛИ KEYSTONE TECHNOLOGIES ПРЕДНАЗНАЧЕНА УБЫТКИ, ИЗДЕРЖКИ ИЛИ УБЫТКИ.

9. Прекращение действия: Настоящее соглашение действует до тех пор, пока у вас есть учетная запись, если оно не будет расторгнуто, как указано ниже. Вы можете прекратить действие любой лицензии, предоставленной в соответствии с настоящим соглашением, уничтожив изображения и любые производные от них работы, а также любые копии или архивы вышеупомянутых или сопроводительных материалов (если применимо) и прекратив использовать изображения для любых целей. Лицензии, предоставленные в соответствии с этим соглашением, также прекращают действие без уведомления Keystone Technologies, если в какой-либо момент вы не соблюдаете какое-либо из условий этого соглашения.Keystone Technologies может расторгнуть настоящее соглашение, а также вашу учетную запись и все ваши лицензии, с уведомлением вас или без него, в случае невыполнения вами условий этого соглашения. После прекращения действия вашей лицензии вы должны немедленно прекратить использование изображений для любых целей; уничтожать или удалять все производные работы с изображениями, а также копии и архивы изображений или сопутствующих материалов; и, если потребуется, подтвердите Keystone Technologies в письменной форме, что вы выполнили эти требования.ВЫШЕУЮЩЕЕ ПРЕКРАЩЕНИЕ ДОПОЛНИТЕЛЬНО ДОПОЛНИТЕЛЬНО ДРУГИЕ ЗАКОННЫЕ И / ИЛИ КАПИТАЛЬНЫЕ ПРАВА Keystone Technologies. Keystone Technologies НЕ НЕСЕТ НИКАКИХ ОБЯЗАТЕЛЬСТВ ПО ВОЗВРАТУ КАКИХ-ЛИБО ПЛАТЕЖНЫХ КОМИССИЙ В СЛУЧАЕ ПРЕКРАЩЕНИЯ ДЕЙСТВИЯ ВАШЕЙ ЛИЦЕНЗИИ ИЛИ УЧЕТНОЙ ЗАПИСИ ПО ПРИЧИНЕ ВАШЕГО НАРУШЕНИЯ.

10. Сохранение прав после прекращения действия: Следующие положения и условия остаются в силе после прекращения или истечения срока действия настоящего соглашения: условия, применимые к лицензиям на изображения, предоставленным в соответствии с настоящим соглашением, остаются в силе в отношении оставшихся лицензий при условии, что настоящее соглашение не прекращается как результат вашего нарушения, и что вы всегда будете соблюдать его условия.

11. Удаление изображений с keystonetech.com: Keystone Technologies оставляет за собой право удалять изображения с keystonetech.com, отозвать любую лицензию на любые изображения по уважительной причине и принять решение о замене такого изображения альтернативным изображением. После уведомления об отзыве лицензии на любое изображение вы должны немедленно прекратить использование таких изображений, принять все разумные меры для прекращения использования замененных изображений и проинформировать об этом всех конечных пользователей и клиентов.

12. Разное: Настоящее соглашение представляет собой полное соглашение сторон в отношении предмета настоящего Соглашения. Стороны соглашаются, что любое существенное нарушение Раздела 3 («Ограничения») нанесет непоправимый ущерб компании Keystone Technologies, и что судебный запрет в суде компетентной юрисдикции будет уместен для предотвращения первоначального или продолжающегося нарушения такого Раздела в дополнение к любому Компания Keystone Technologies может иметь право на другие льготы. Если мы не сможем обеспечить соблюдение каких-либо частей этого соглашения, это не означает, что от таких частей отказываются.Это соглашение не может быть передано вами без нашего письменного разрешения, и любая такая предполагаемая передача без разрешения является недействительной. Если какая-либо часть этого соглашения будет признана незаконной или не имеющей исковой силы, эта часть должна быть изменена для отражения наиболее полного юридически обеспеченного намерения сторон (или, если это невозможно, удалена), не влияя на действительность или исковую силу остальной части.