Способ и устройство для сушки гелевых пластин
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ Настоящее изобретение относится к лабораторным методам и оборудованию для сушки плоских гелевых пластин после электрофоретического разделения. В частности, это изобретение относится к фиксации гелей и расположению полос в них в целях сохранения и точного анализа электрофоретического рисунка. Существующие устройства для фиксации пластин геля путем дегидратации обычно используют как тепло, так и вакуум для испарения влаги. из геля. Одним из нескольких примеров такого устройства в опубликованной литературе является устройство, раскрытое в Hoefer, U.S. Pat. № 4 020 563 (от 03.05.1977). Сушка геля затруднена тем фактом, что гель при высыхании превращается в хрупкое твердое вещество, непроницаемое для жидкости. Таким образом, когда локальный нагрев или испарение высушивают поверхность или область гелевой плиты, влага в соседних областях должна найти путь вокруг высушенных областей, чтобы выйти. Часто внутри геля может задерживаться влага.
По мере того, как захваченная влага испаряется и продолжает расширяться, давление внутри геля увеличивается и возникают боковые напряжения, вызывающие растрескивание высыхающего геля. Кроме того, когда появляются мельчайшие трещины, они быстро расширяются по мере того, как захваченный под давлением пар пытается высвободиться. СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ В настоящем документе предложены устройство и способ для сушки гелевой пластины с улучшенными результатами по сравнению с предшествующим уровнем техники. Как в устройстве, так и в способе источник вакуума, помещенный под горизонтально поддерживаемой пластиной геля, комбинируется с нагревательной пластиной веса, установленной на верхней части пластины, сжимающей пластину под действием силы тяжести. Испаряющаяся влага, покидающая пластину, стекает вниз от источника тепла с одинаковой скоростью во всех точках пластины геля, а контактное давление нагревательного элемента остается постоянным на протяжении всего процесса сушки по мере уменьшения толщины геля.
Параллельные градиенты температуры и давления поддерживаются для обеспечения равномерного высыхания геля без захвата влаги или повышения давления внутри геля. Результатом является существенное улучшение устойчивости гелевой пластины к растрескиванию во время обезвоживания. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙРИС. 1 представляет собой вид в перспективе иллюстративного сушильного устройства согласно настоящему изобретению с оторванными частями, в котором нагревательная пластина встроена в откидную крышку, показанную в открытом положении. Фиг. 2 представляет собой вид сбоку в разрезе крышки и нагревательной пластины варианта осуществления, показанного на фиг. 1 по линии 2-2. На фиг. 3 представляет собой вид спереди в разрезе крышки и нагревательной пластины варианта осуществления по фиг. 1 по линии 3-3. На фиг. 4 представляет собой вид спереди в разобранном виде устройства, показанного на фиг. 1 по линии 4-4.
ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ВЫПОЛНЕНИЯ Сушилка 10 с гелевыми пластинами, представляющая иллюстративный вариант осуществления настоящего изобретения, показана на фиг.
1. Сушилка состоит из основания 11 и крышки 12. Обе конструкции обычно имеют прямоугольную форму, причем крышка шарнирно прикреплена к основанию с помощью шарнирного соединения вдоль одного из длинных краев, образующих заднюю часть устройства. в основании сформирована лунка 13 для приема пористой опорной прокладки 14 с плоской горизонтальной верхней поверхностью 15 достаточных размеров для поддержки влажного гелевого сляба. Размер и форма опорной подушки не имеют решающего значения при условии, что ее поверхность 15 имеет по меньшей мере такую же протяженность, что и пластина геля. Во время типичной процедуры сушки гель прокладывается между защитными листами, выходящими за его края. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления сушильного устройства поверхность подушечки длиннее и шире, чем гель, оставляя край, окружающий гель, достаточной ширины, чтобы приспособиться к избыточной ширине защитных слоев. Поскольку пластины геля, используемые в электрофорезе, обычно имеют прямоугольную форму , углубление 13 и опорная площадка 14, показанные на чертеже, также имеют прямоугольную форму, при этом углубление имеет плоскую нижнюю поверхность 16 и прямые боковые стенки 17.
Нижняя поверхность имеет центральное отверстие 18, через которое всасывается вакуум. Порт 18 соединяется, как показано, с внешним трубным соединением 18а сбоку или сзади основания для присоединения к вакуумной трубке, ведущей к источнику вакуума. Можно использовать обычную лабораторную вакуумную линию. В типичной работе вакуум представляет собой частичный вакуум не менее примерно 23 дюймов ртутного столба (абсолютное давление менее примерно 200 торр). Для достижения равномерной скорости сушки по всей поверхности гелевой пластины сила вакуума должна быть растянута от вакуумного порта 18, чтобы охватить всю длину и ширину геля. Чтобы способствовать этому эффекту растекания, верхняя и нижняя поверхности опорной подушки 14 соединены открытыми порами или проходами 19.достаточно узким или изогнутым, чтобы обеспечить сопротивление потоку, которое расширит область, из которой газ или пар всасываются в вакуумный порт. Соответственно, прокладка может быть изготовлена из таких материалов, как пористый полиэтилен или другой жесткий пенопласт, спеченный металл или связанные стеклянные шарики.
стенки 17 и открывающиеся в вакуумный порт 18. Они позволяют парам проходить к вакуумному порту с существенно меньшим сопротивлением потоку, чем поры 19.в опорной прокладке и, таким образом, стремится поддерживать по существу равномерное давление вдоль дна скважины, в то время как пар проходит через прокладку. В предпочтительных вариантах канавки радиальные и симметрично расположены вокруг вакуумного порта, как показано на фиг. 1. В результате испаряющаяся влага, выходящая из геля, втягивается прямо вниз с равномерной скоростью по всему поперечному пространству геля, оставляя гель свободным от боковых напряжений на протяжении всего процесса сушки. и дно уложено плоско поверх опорной подушки 14, причем все его края находятся внутри кромок подушки. Затем плиту покрывают гибким покровным листом 21 в виде створки, охватывающей всю полость 13 и перекрывающей бортик 22, образованный верхними краями боковых стенок 17. Таким образом, покровный лист и полость образуют замкнутую камеру. для сохранения вакуума.
Покрывающий лист изготовлен из материала, способного удерживать вакуум, но при этом достаточно деформируемого, чтобы герметизироваться вокруг обода 22, когда давление внутри камеры снижается. Толщина опорного блока 14 такова, что его верхняя поверхность находится на достаточной высоте. обеспечить полный контакт геля с покровным листом (через верхний защитный слой) перед применением вакуума. Давление, оказываемое покровным листом на гель при вакуумировании камеры, будет тогда равномерным по всей площади контакта между пластиной геля и покрытием. Покрытие 20 предпочтительно вырезается из прозрачного материала, чтобы оператор устройства мог контролировать процесс сушки. Примером такого материала является прозрачный силиконовый каучук. Крышка, показанная на чертеже, прикреплена к основанию с одной стороны, что позволяет поднимать крышку для легкой установки и удаления опорного блока и гелевой пластины. Крышка 12 аппарата поддерживает плавающую нагревательную пластину 23. Пластина удерживается в крышке с помощью свободного крепления без трения, которое обеспечивает достаточную степень свободы пластины в направлении, перпендикулярном крышке, так что, когда крышка закрыта, нижняя поверхность пластины опирается на верхнюю часть гибкой крышки 20 под ее полным гравитационная сила и никакая другая.
Одним из примеров такого соединения, показанного на чертежах, является ряд стоек 24, отходящих вниз от внутренней поверхности крышки, каждая из которых стыкуется с выступом или кольцом, выступающим вверх от нагревательной пластины. В удобной конструкции одна такая стойка расположена рядом с каждым из четырех углов крышки. Одна из четырех комбинаций стойки и кольца подробно показана на фиг. 2. В показанном варианте осуществления кольцо представляет собой отверстие 25 в L-образном выступе 26, выступающем вверх от нагревательной пластины 23 вблизи угла пластины. Отверстие имеет больший диаметр, чем стержень 27 стойки, что обеспечивает свободную посадку для скольжения язычка по стержню без трения. Расширенное основание стойки 28, имеющее больший диаметр, чем отверстие 25, ограничивает путь перемещения рычага, тем самым удерживая нагревательную пластину в крышке, когда крышка поднимается. Длина каждого стержня и, следовательно, диапазон высоты нагревательной пластины 23 выбираются таким образом, что когда крышка 12 закрыта на основании 11, пластина находится в контакте с покровным листом 21, а каждое отверстие 25 находится на расстоянии от обоих пределов вала, оставаясь таким, чтобы гель сжимался.
по толщине при сушке. Следовательно, нагревательная пластина оказывает на гель постоянную гравитационную силу в течение всего процесса сушки. Нагревательная пластина 23 и связанные с ней элементы управления показаны на фиг. 3. Нагревательная пластина может иметь любую обычную конструкцию, обеспечивающую по существу равномерную передачу тепла на пластину геля. Особенно удобен, например, нагревательный элемент с электрическим сопротивлением. Типичные такие элементы могут быть изготовлены из электропроводки, вплетенной между листами силиконовой резины, или любой другой обычной конструкции для грелки. В варианте, показанном на чертежах, плита имеет ламинированную конструкцию, состоящую из плоского нагревательного элемента 29.приклеен к пластине из теплопроводного материала 30, такого как алюминий или медь. Пластина способствует равномерному распределению тепла, генерируемого нагревательным элементом, и, будучи помещенной над нагревательным элементом, как показано, передает температуру элемента термостатам 31, 32, 33.
Пластина 30 также обеспечивает массу нагревательной пластине, увеличение силы, с которой пластина контактирует с покровным листом 21 над гелевой пластиной. Общий вес пластины не является критическим и может варьироваться в широких пределах. Как правило, наилучшие результаты дает пластина весом от примерно 0,5 до примерно 5 граммов на квадратный сантиметр контактной поверхности, предпочтительно от примерно 0,75 до примерно 3 граммов на квадратный сантиметр. Было обнаружено, что пластины весом от примерно 1,1 до примерно 1,3 грамма на квадратный сантиметр особенно удобны. Регулирование температуры нагревательной пластины может быть достигнуто в соответствии с обычными методами. Вариант осуществления, показанный на чертежах, содержит ряд термостатов 31, 32, 33, обеспечивающих гибкость устройства для удовлетворения потребностей в гелях различной толщины и концентрации. Особенно полезное устройство включает настройку низкой температуры и настройку высокой температуры, а также защиту от перегрева, поэтому показаны три термостата.
Например, термостат слабого нагрева, установленный на 60°С. C. подходит для анализа гелей с помощью авторадиографии или подобных систем, которые подвержены потере точности при более высоких температурах, тогда как термостат высокого уровня может быть установлен на 80°С. C. для использования с другими системами. Выбор регулирующего термостата можно контролировать с помощью переключателя 34 на внешней стороне устройства, показанного на фиг. 1. Третий термостат может быть настроен на отключение нагревателя, когда температура превышает заданный максимум, например, при понижении температуры. 90° C. Это служит защитой от перегрева в случае выхода из строя управляющего термостата, подключенного к сети. Другие дополнительные функции включают в себя таймер 35 для нагревательного элемента и световой индикатор 36, показывающий, включен ли таймер или нет, указывая, таким образом, на завершение последовательности сушки. На фиг. 4 все устройство показано в разобранном виде спереди с крышкой, снятой с петель, и, кроме того, включая пластину геля и защитные слои.
На этом изображении показана изолирующая прокладка 37, которая устанавливается внутри основания 11 напротив нижней стороны 38 нижней поверхности колодца 13. В изолирующей прокладке имеется отверстие 39.для размещения вакуумного трубопровода. Размещенная таким образом изолирующая прокладка помогает системе удерживать тепло для более эффективной сушки. Как показано на фиг. 4, система предназначена для использования с пластиной 40 геля, ограниченной защитными слоями 41 и 42 снизу и сверху, соответственно, которые обычно используются для сушки и фиксации пластин геля. Материалы для защитных слоев могут быть материалами, обычно используемыми в предшествующем уровне техники. Нижний защитный слой представляет собой лист, достаточно пористый, чтобы через него мог проходить пар, и достаточно сорбирующий, чтобы связываться с гелем по мере его высыхания. Обычно используют обычную лабораторную фильтровальную бумагу различных сортов или целлофан. Верхний защитный лист 37 может быть пористым или непористым, но в любом случае легко деформируемым.
При применении вакуума верхний лист будет плотно прилегать к краям геля. Когда лист изготовлен из пористого материала, такого как целлофан, гель будет прилипать к нему при высыхании. Поэтому лист должен быть прозрачным, чтобы можно было провести визуальный анализ после завершения сушки. Примерами прозрачных непористых материалов являются Saran Wrap™, Glad Wrap™ и Mylar™. Неадгезивные пористые материалы, такие как пористый полиэтилен или пористый полипропилен, удаляются из высушенного геля и поэтому не должны быть прозрачными. Однако в целом предпочтительны прозрачные материалы как для верхнего защитного листа 41, так и для покровного листа 21 сушильного устройства, чтобы можно было визуально контролировать ход сушки без нарушения вакуума. В некоторых случаях верхний защитный слой может быть полностью исключен, а покровный лист 21 может служить единственной защитой верхней поверхности гелевой пластины. Вышеприведенное описание приведено в первую очередь в иллюстративных целях. Специалистам в данной области техники будет очевидно, что многочисленные модификации и вариации материалов, конструкции и методов, раскрытых выше, могут быть введены без отклонения от сущности и объема изобретения, как определено прилагаемой формулой изобретения.
» Изготовьте гелевые диски и проведите анализ Alamarblue для эксперимента.
Агароза и альгинат широко используются в литературе для создания трехмерных культуральных конструкций. Преимущество альгината в том, что его не нужно нагревать для затвердевания. Вы просто добавляете альгинат натрия к раствору кальция и получаете гель! Поэтому мы решили воспользоваться этим свойством альгината, чтобы создавать гелевые конструкции, не убивая наши клетки нагреванием.
Мы смешали 2% альгинат натрия с 102 мМ раствором соли кальция в лунке, надеясь, что получится хороший диск. Но нет! Мы получили это.
Попробуйте сделать альгинатный гель
Аморфная капля неровной консистенции!! После консультации с экспертом по гелям в лаборатории нам сказали, что для изготовления альгинатного геля определенной формы нам нужно будет сконструировать негативную форму из агарозы и залить раствор альгината в форму. Запечатайте его и погрузите агарозную форму с альгинатом в бассейн с раствором кальция.
Учитывая сложность изготовления альгинатных гелей, мы решили использовать агарозу для изготовления наших дисковых конструкций. Хотя нам нужно нагреть раствор агарозы до температуры кипения, мы можем использовать легкоплавкую агарозу. Как этот!
Легкоплавкая агароза
Температура гелеобразования также довольно низкая, намного ниже 37 градусов по Цельсию. БОЛЬШОЙ! Так что мы не будем убивать клетки, засевая их горячим раствором агарозы!
Далее нам нужно выяснить, как сделать круглые гелевые диски, которые будут сжиматься нашим биореактором.
Сэндвич-конструкция из геля
Изначально мы разработали гелевые конструкции, состоящие из двух слоев агарозного геля с тонким слоем клеток посередине. В идеале это могло бы облегчить процесс конфокальной визуализации, поскольку все клетки могут быть захвачены в одном слое, а клетки более доступны для окружающей среды.
Сначала мы столкнулись с проблемой изготовления гелей с помощью разработанных нами инструментов.
GelMolder
GelPoker
Мы разработали устройство для формования геля (3D-печать), которое должно было нарезать 96 гелевых дисков и перенести их в луночный планшет. А затем мы использовали кочергу, чтобы вытолкнуть гелевые диски через отверстия формовщика. Таким образом, мы могли создавать гелевые конструкции с высокой производительностью.
Однако гель-формовщик, который мы напечатали в 3D, не собирал диски с гелевой плиты. А длина плунжеров кочерги была слишком короткой, чтобы они не могли дотянуться до другого конца полых лунок и, следовательно, не могли коснуться гелевых дисков высотой 3 мм.
В результате нам пришлось использовать перфоратор для биопсии, чтобы пробить пластину геля 96 раз, и использовать пинцет, чтобы взять диски и перенести их в луночный планшет! Этот шаг действительно необходимо автоматизировать в будущем, иначе он сведет на нет всю цель создания «высокопроизводительного» биореактора.
Сделайте пробойник
Возьмите гелевый диск пинцетом
В процессе переноса гелевых конструкций. БУДЬ ОЧЕНЬ ОСТОРОЖЕН!
Удачи, попробуйте поместить гелевую конструкцию в центр лунок!
Еще одна проблема, связанная с приготовлением гелевого сэндвича, — неровная поверхность геля. Мы вылили расчетное количество агарозы на чашку Петри, чтобы получить желаемую высоту, и подождали, пока она превратится в гель, прежде чем добавить слой клеток. Без каких-либо ограничений на верхнюю часть верхняя поверхность может принимать любую форму. Он может выпирать, деформироваться и мешать. Не круто. Это привело к образованию дисков неравномерной высоты. Юк!
Более того, когда мы добавили второй слой геля и попытались вытащить сэндвич-конструкт пинцетом, два слоя геля разошлись!!! КОШМАР!!!!
На данный момент становится ясно, что подход с гелевым сэндвичем был не лучшим способом изготовления маленьких гелевых дисков. И нам действительно нужно было найти способ сделать плоские, красивые гелевые пластины!
Поскольку мы умные, умные студенты, мы быстро нашли другой способ делать идеально плоские гелевые пластины!
Сделайте пластину геля с помощью вестерн-блоттинга!
Как показано на рисунке, для изготовления гелевых пластин мы использовали два куска стекла, разделенные прокладкой (черный резиновый элемент) толщиной 2,8 мм.
Идеально ровная пластина геля!!
Сначала мы нагрели 4% раствор агарозы до температуры кипения. После охлаждения ниже температуры тела мы смешали его с равным объемом среды для выращивания тканевых культур (розового цвета) с определенной концентрацией клеток, чтобы получить раствор агарозы с конечной концентрацией 2%. Затем мы загружали наш раствор агарозы, засеянный клетками, в устройство для приготовления геля и ждали, пока он затвердеет. Мы измерили, что фактическая высота гелевого диска составляет 2,57 мм, что немного меньше, чем у прокладки из-за силы, прикладываемой зажимами.
Измеряем фактическую высоту нашей гелевой конструкции!
Отлично! Теперь мы сделали гелевые диски, засеянные клетками.
Следующим шагом будет проведение анализа жизнеспособности клеток. Мы хотим убедиться, что 1) реагент анализа может диффундировать через гели и достигать клеток; 2) клетки здоровы и живы внутри гелевых конструкций. Мы решили использовать анализ alamarBlue, потому что он прост в выполнении и не является конечным анализом. Вы можете продолжать тестировать жизнеспособность клеток с течением времени. Он указывает на здоровье клеток, используя восстанавливающую способность живых клеток для количественного измерения пролиферации различных типов клеток. Резазурин, активный реагент alamarBlue, представляет собой нетоксичное, проницаемое для клеток соединение, имеющее синий цвет и практически не флуоресцирующее. При попадании в клетки резазурин восстанавливается до резоруфина, соединения красного цвета с высокой флуоресценцией. Жизнеспособные клетки непрерывно превращают резазурин в резоруфин, увеличивая общую флуоресценцию и цвет среды, окружающей клетки.
Гелевые конструкции с засеянными клетками инкубировали с alamarBlue в среде в течение ночи.